基于ISSR标记的扁玉螺(Neverita didyma)自然居群遗传结构

利用ISSR分子标记技术,对采自大连(DL)、烟台(YT)及青岛(QD)近海的扁玉螺3个自然居群的遗传结构和遗传多样性进行了分析。用13个引物对90只个体进行了PCR扩增,共检测到161个位点,3个居群的多态位点比例为74.53%～85.09%,各居群遗传多样性水平的高低依次为YT>QD>DL。扁玉螺在物种水平上的Nei’s基因多样性指数和Shannon’s信息指数分别为0.3395和0.5113,在居群水平上分别为0.2811和0.4189,显示出扁玉螺有着较高的遗传多样性。AMOVA分子变异分析表明,扁玉螺的遗传变异有27.16%发生在居群间,72.84%发生在居群内,居群内的遗传变异大于居群间的遗传变异。扁玉螺3个居群间的遗传分化系数(Gst)为0.1720,基因流(Nm)为2.4063,Nei’s遗传距离平均值为0.1228,表明扁玉螺居群间虽然存在着一定程度的遗传分化,但仍属于种内正常分化的范畴。上述结果为保护和利用扁玉螺资源提供了科学依据。

扁玉螺(Neverita didyma)表型性状对体重和软体部重的影响效应分析

采用相关分析和通径分析的方法,研究了扁玉螺的表型形态性状对体重和软体部重的影响。随机抽取2龄扁玉螺100只,分别测定其壳宽、壳高、壳顶至胼胝高、体高、厣长、厣宽、体重、软体部重共8项性状参数,并分别计算了各性状间的相关系数,以及以表型性状为自变量对体重和软体部重作因变量的通径系数和决定系数。结果表明,各表型性状与体重、软体部重之间的相关系数均达到极显著水平(P<0.01)。壳宽对体重和软体部重的直接效应均为最大,对二者的决定程度也最高,是影响体重和软体部重的最主要因素;而厣宽、壳顶至胼胝高和体高的直接作用较小,它们主要通过壳宽的间接作用影响体重和软体部重。因此,对壳宽的直接选择可有效地增加体重和软体部重,对壳顶至胼胝高、厣宽和体高的选择也有助于增加扁玉螺的重量。

扁玉螺(Neverita didyma R  ding)消化系统的形态学研究

扁玉螺消化系统由消化道——口、食道、胃、肠和直肠以及消化腺——食道腺和肝脏组成，无唾液腺．消化道粘膜上皮有纤毛柱状细胞、杯状细胞和颗粒细胞三种细胞．食道腺仅有一种腺细胞．肝脏由消化细胞、隐窝细胞和贮藏细胞组成。

扁玉螺蛋白质、脂肪含量的季节变化

测定和分析了1999年12月～2000年11月的扁玉螺不同部位的蛋白质和脂肪。结果表明 ,扁玉螺蛋白质和脂肪的季节变化都与水温和繁殖季节有关 ,存在明显的季节性 ,但不存在明显的性别差异。蛋白质以足部最高 ,为82.04 % ;性腺和肝脏的蛋白质都比较低 ,小于70 %。脂肪以足部最低 ,仅有1.83 % ;性腺和肝脏的脂肪都比较高 ,尤其是雌性性腺 ,年平均为12.85 % ,4月份可高达19.36 %。

扁玉螺体表和消化系统甲硫氨酸脑啡肽免疫组织化学定位

采用免疫组织化学strept avidin-biotin complex(S-ABC)法对甲硫氨酸脑啡肽(methionine-enkephalin,M-ENK)在扁玉螺(Neverita didyma)体表、消化系统各器官中的分布进行了研究。结果表明,扁玉螺的足上皮细胞、外套膜的内外上皮细胞以及食道、胃、肠道的黏膜上皮细胞均呈M-ENK阳性反应,且消化道中的阳性反应多集中于上皮细胞游离端;在食道腺的腺上皮中也有少量阳性细胞分布;肝是M-ENK阳性细胞分布较多的器官,主要分布在肝小叶中腺细胞边缘游离端。M-ENK在扁玉螺体表和消化系统各器官均有分布,且分布密度有所不同,可能与各部位的功能有关。

扁玉螺植物消化特性的初步研究

对扁玉螺各消化器官消化酶活力测定表明，扁玉螺有一定的消化植物的能力，其中淀粉水解能力相对较高和较稳定，纤维素水解能力低，没有褐藻酸水解能力，海藻多糖水解能力不稳定，蛋白质和脂肪水解能力处于相对较低的水平．比较各消化器官重量和蛋白含量，表现唾液腺和肝脏的作用接近，胃、小肠和直肠作用接近。

扁玉螺(Neverita Didyma Roding)消化系统的组织化学研究

以多种组织化学方法研究了扁玉螺的消化系统．除直肠外，其余消化道的纤毛柱状细胞呈现蛋白酶、非特异性酯酶和脂酶活性，其游离端质膜呈现碱性磷酸酶活性．杯状细胞分泌弱硫酸化酸性粘多糖．食道腺腺细胞以及肝脏消化细胞显示蛋白酶、非特异性酯酶和脂酶活性，后者还显示酸性磷酸酶活性．隐窝细胞含有铁．

舟山海域扁玉螺和玉螺食用价值评估

为评估舟山海域扁玉螺和玉螺的营养水平,确定其食用价值和养殖开发前景,采用常规营养指标测定方法对两种玉螺软体部分营养成分进行测定,分析比较一般营养成分、氨基酸、脂肪酸、矿物元素等组成,并对其营养成分进行评价。结果表明:扁玉螺和玉螺具有高蛋白低脂肪的特征,扁玉螺蛋白质总含量(以湿质量计)为19.34%,玉螺为15.55%,二者包括常见的18种氨基酸,其中8种人体必需氨基酸齐全,分别占氨基酸总含量的33.93%(扁玉螺)和36.19%(玉螺),两种玉螺中的4种鲜味氨基酸含量丰富,占氨基酸总量将近40%,扁玉螺的氨基酸比值系数分为51.59,玉螺为45.41;两种玉螺软体部分脂肪酸以不饱和脂肪酸为主(含量均超过60%),其中二十碳五烯酸+二十二碳六稀酸(EPA+DHA)接近20%;两种玉螺软体部分K含量最高,其次为Mg;微量元素中Fe含量最高,其次为Zn,扁玉螺和玉螺的Zn与Cu质量比分别为3.39和5.05,Zn与Fe质量比分别为0.33和0.80,说明两种玉螺的Cu、Fe、Zn的比值较为合理。扁玉螺和玉螺均是营养价值较高的海水经济贝类,具有很高的食用价值及广阔的养殖前景和市场开发潜力。

扁玉螺早期发育的实验观察

在实验室条件下人工孵化扁玉螺（Neverita didyma）的卵块,观察了其胚胎发育和幼虫发育过程。扁玉螺的早期发育属间接发生型,其胚胎发育包括卵裂期、囊胚期、原肠胚、膜内担轮幼虫、膜内面盘幼虫;幼虫发育包括面盘幼虫、后期面盘幼虫和匍匐幼虫;匍匐幼虫经变态后发育为稚螺。在水温25～26℃条件下,受精卵发育至膜内面盘幼虫约需38h,5～6d后面盘幼虫冲破卵膜而孵化。扁玉螺面盘幼虫的显著特点是具有1对眼点和1对平衡囊,面盘呈双叶状;后期面盘幼虫的面盘为4叶,呈蝴蝶状,足发达,幼虫既能浮游,又能爬行。后期面盘幼虫进一步生长发育,逐渐转入匍匐生活。

扁玉螺多糖的提取及含量测定

[目的]对扁玉螺多糖的提取条件进行优化并测定多糖的含量。[方法]采用苯酚-硫酸比色法测定多糖的含量,以多糖的得率为指标,在单因素分析的基础上进行正交分析,优化扁玉螺多糖的提取工艺条件。[结果]最佳提取条件为:提取温度40℃,料液比1∶100(g/ml),提取时间60 min;在此提取条件下,扁玉螺多糖的提取率为7.17%,RSD为1.05%。[结论]该方法简便可靠,为扁玉螺多糖的进一步开发利用提供了依据。

扁玉螺ISSR-PCR反应体系的建立及其优化

以扁玉螺基因组DNA为材料,分析了Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物以及模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响,建立了一套适合扁玉螺的ISSR-PCR反应体系。该反应体系包括:2.0mmol·L-1的Mg2+,0.25 mmol·L-1的dNTP,0.8 U的Taq DNA聚合酶,0.2μmol·L-1的ISSR引物和40 ng模板DNA。利用优化后的反应体系,从30条ISSR引物中筛选出13条扩增效果较好的引物,为进一步利用ISSR标记研究扁玉螺的遗传多样性奠定了基础。

扁玉螺的生殖腺组织学和生殖周期

采用组织切片和HE染色法,对烟台沿海扁玉螺的生殖腺发育过程进行了观察。根据性腺发育的组织学特征,将扁玉螺生殖腺发育过程分为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期5个时期;扁玉螺在烟台沿海每年一个生殖周期,繁殖季节为5月上旬至8月中旬,繁殖盛期为6月上旬至7月下旬。上述研究结果探明了扁玉螺的生殖腺发育规律,丰富了扁玉螺的繁殖生物学资料,对开发利用扁玉螺有着积极的意义。

温度和规格对扁玉螺耗氧率和排氨率的影响

在实验生态条件下 ,研究了温度对不同个体大小扁玉螺耗氧率和排氨率的影响。实验结果表明 ,在实验温度 ( 1 0～ 35℃ )条件下 ,扁玉螺的个体耗氧率 (R′O) [mg/个·h]和个体排氨率 (R′N) [mg/个·h]与软体部干重 (W)呈正相关 ,而耗氧率 (RO) [mg/g·h]、排氨率 (RN) [mg/g·h]与软体部干重呈负相关 ,二者之间均可用幂函数表示 ;扁玉螺的耗氧率和排氨率均随温度的升高而增加 ,但超过 30℃后 ,耗氧率则下降 ,耗氧率 (RO)、排氨率 (RN)与温度之间呈明显的指数函数关系。不同规格扁玉螺的耗氧率和排氨率的比值 (原子数O :N)在 2 0℃时最大。方差分析表明 ,温度、软体部干重对扁玉螺的耗氧率和排氨率有极显著的影响 (P <P0 .0 1 )。

扁玉螺、罗氏海盘车中牛磺酸的HPLC测定

利用高效液相色谱OPA柱前衍生法测定扁玉螺(Nevertia didyma(Roding))肝脏、腹足,罗氏海盘车(Asterias rollestoni Bell)内脏、体壁中牛磺酸的含量。实验结果表明,100g(湿质量)样品中牛磺酸含量分别为535.2、1298.7、60.4、31.7mg。

重金属离子对扁玉螺细胞色素氧化酶的影响研究

测定了扁玉螺（ＮｅｖｅｒｉｔａｄｉｙｍａＲｏｄｉｎｇ）肝脏中细胞色素氧化酶活力，其最适温度为４４°Ｃ，最适ｐＨ值７．０．研究了Ｆｅ３＋，Ｃｕ２＋，Ｚｎ２＋三种重金属离子在离体（ｉｎｖｉｔｒｏ）条件下对该酶的影响，结果显示：低浓度的Ｆｅ３＋，Ｃｕ２＋对其具有激活作用，高浓度的Ｆｅ３＋，Ｃｕ２＋及低浓度的Ｚｎ２＋对其具有显著的抑制作用．

黄、渤海扁玉螺(Neverita didyma)表型变异分析

采用多变量形态分析方法,对黄、渤海海域的丹东、烟台、青岛、赣榆、昌黎和莱州6个地理居群的扁玉螺的表型形态变异进行了研究。主成分分析构建了3个主成分,第一、第二和第三主成分的贡献率分别为41.68%、28.45%和27.67%,累计贡献率达97.80%。聚类分析结果显示,烟台居群与青岛居群之间的形态最为接近,二者首先聚为一支;丹东居群与赣榆居群聚为另一分支;昌黎居群、莱州居群与其它居群的趋异程度较大。方差分析和Duncan's多重比较表明,扁玉螺各居群之间的若干形态差异显著(P<0.05)。利用逐步判别法进行判别分析,建立了6个居群的判别函数,判别准确率P1为52.9%—86.5%,P2为52.4%—89.1%,综合判别准确率为74.4%。上述结果显示,6个居群的扁玉螺在表型形态上已出现了一定程度的变异,壳高、壳顶至胼胝高是反映其形态变异的主要性状,但各居群间的变异尚未分化到亚种水平。

ISSR标记在扁玉螺中的初步应用

以扁玉螺基因组DNA为材料,分析了Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物以及模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响,建立了一套适合扁玉螺的ISSR-PCR反应体系。该反应体系包括:2.0mmol/L的Mg2+,0.25mmol/L的dNTP,0.8U的TaqDNA聚合酶,0.2μmol/L的ISSR引物和40ng模板DNA。利用优化后的反应体系,从30条ISSR引物中筛选出了13条扩增效果较好的引物,这为进一步利用ISSR标记研究扁玉螺的遗传多样性打下了基础。

扁玉螺生殖腺透射电镜制作方法优化

以扁玉螺为材料,运用透射电镜技术,对其生殖腺进行了电镜超薄制片,染色后在透射电镜下观察获得了良好清晰的细胞超微结构图像。