葡萄扇叶病毒的分离、鉴定、提纯及血清学研究

从表现扇叶和叶肉褪绿斑驳症状的先锋、葡萄园皇后和北醇的杂交单株中分离到3个与国外扇叶病毒(GFV)DIL分离物相似的GFY-DIL类似物。它们在昆诺藜、苋色藜、千日红和菜豆上表现症状。提纯病毒颗粒为直径约30nm的球形颗粒。在免疫双扩散试验中均与扇叶病毒抗血清形成完全融合的沉淀线。免疫电镜下病毒颗粒受扇叶病毒抗血清的修饰。利用三种间接异种动物抗体双夹心法和金黄色葡萄球菌蛋白A夹心酶联免疫吸附试验(PAS—ELISA)从感病的葡萄植株或组培苗叶片中检测了GF。间接异种动物抗休双夹心法能检测提纯GFV的最低浓度为1.6ng—8ng/ml。春季的芽和幼叶为合适的检测器官。

利用RT-PCR检测葡萄扇叶病毒的研究

以一年生品丽珠葡萄品种为试材，改进葡萄叶片总RNA的提取方法，获得了纯度较高、完整性较好的总RNA，在此基础上进行反转录和PCR扩增，检测到了葡萄扇叶病毒（GFLV), 建立了GFLV的RT－PCR检测程序，并得到应用。

葡萄扇叶病毒移动蛋白在寄主体内的动态检测和免疫金标记

利用葡萄扇叶病毒法国分离物F1 3 (Grapenivefanleafvirus,GFLV F1 3 )移动蛋白抗体对杭州分离物 (GFLV H)移动蛋白进行Westernblot,分析表明移动蛋白在接种GFLV H 3d后的苋色藜 (Chenopodiumamaranticolor)系统叶中就可检测到 ,随着时间推移 ,其积累量逐渐升高 ,接种 1 6d后达到最高值。接种 3 2d后的病叶已经枯黄 ,但移动蛋白积累量并没有减少。超薄切片电镜观察发现 ,在感染GFLV H的昆诺藜 (C .quinoa)和苋色藜的叶肉组织薄壁细胞中 ,病毒粒子呈纵列整齐地排列在小管状结构中 ,在胞间连丝中也发现有管状结构。免疫金标记显示胶体金能定位在细胞质、细胞壁和胞间连丝上 ,在管状结构也发现有少量的金粒子。

协同凝集试验快速诊断葡萄扇叶病毒

本文描述一个新的试验方法,即协同凝集试验,用于检测葡萄扇叶病毒(GFV)。检出OFV 的最低浓度为4ng/ml,其灵敏度与 ELISA 检测病毒水平相当,而且更简便、快速。

葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因的克隆,序列分析及其在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR方法把葡萄扇叶病毒(GFLV)外壳蛋白基因(CP gene)分成两部分扩增,扩增产物克隆入pGEM-5Zf(+)载体,并通过BglⅢ位点连接成一完整的外壳蛋白基因,通过序列分析测得全长外壳蛋白基因为1512bp,编码504个AA＇s,与国外株系GFLV-F13相比,核苷酸同源性为88.4％,氨基酸同源性为95.8％。并且这一外壳蛋白基因在大肠杆菌E.coli DH-5α中得到了表达。

葡萄扇叶病毒引起的寄主细胞病变研究

电镜观察了葡萄扇叶病毒杭州分离物 (Grapevine fanleaf virus Hangzhou isolate,GFLV- H)侵染苋色藜 (Chenopodium amaranticolor)和昆诺藜 (C.quinoa)的细胞超微结构变化。病毒粒子存在于叶肉组织薄壁细胞的细胞质内 ,常成单纵列排列在小管结构中 ,小管形成聚集体。在系统感染的昆诺藜细胞中位于管状结构中的病毒粒子穿过胞间连丝。 2种感病寄主细胞质内膜结构增生 ,在核周围形成含细纤维状物质的小囊泡。液泡边缘存在少许小泡 ,有多泡体和髓鞘样结构伸入液泡 。

葡萄扇叶病毒RT-PCR检测技术研究

以扇叶病株为材料,根据病毒编码外壳蛋白的核苷酸序列,设计特异引物P_1(1,064—1,083),P_2(762—781),建立了以RNA为模板的GFLV的RT-PCR检测体系。PCR产物电泳谱带明显,与预期的引物应扩增321 bp片段完全吻合。并利用建立起来的技术体系,对田间葡萄进行了随机取样检测,取得了很好效果。此方法操作简单,检测周期短,准确率高,具有广泛和更进一步的应用价值。

间接酶联免疫吸附试验检测葡萄扇叶病毒的研究和应用

采用蛋白A抗体夹心和异种动物抗体夹心两种间接酶联免疫吸附试验(ELISA)直接检测葡萄叶片和试管苗中的葡萄扇叶病毒,使试验程序简化,灵敏度与双抗体夹心ELISA直接法相当或较高。检测结果表明,经检测的103样品,其中田间品种扇叶病毒带毒率高达74.3%,热处理试管苗为5.6%,国外引进的脱毒品种(系)也有17.7%带毒。

生物素标记GFV－cDNA探针的制备及在检测葡萄扇叶病毒上的应用

以整合到质粒中的ＧＦＶ－ｃＤＮＡ为模板经ＰＣＲ合成了生物素标记的ＧＦＶ单、双链探针。用合成的探针对提纯的ｃＦＶ－ＲＮＡ＿２、感染ＣＦＶ的昆诺藜叶及１８株而萄进行ＤＮＡ－ＲＮＡ杂交检测表明：检测提纯病毒ＲＮＡ＿２的灵敏度为１．５ｐｇ／斑点，感染ＧＦＶ的昆诺藜提取液最高稀释度可达４０９６０倍；１１株显示典型扇叶症状的样品杂交结果均为阳性，且汁液稀释４００～８００倍仍能测出，７株不显示典型扇叶症状的葡萄中３株受到ＧＦＶ的侵染。单、双链探针最适使用浓度分别为１／２００及１／１００。

葡萄扇叶病毒的ELISA检测技术

本文是关于葡萄扇叶病毒ＥＬＩＳＡ检测技术的报告。采用Ｌ．ｐｉｎｋ的方法提纯病毒，制备了兔抗血清和小鼠腹水抗体，效价分别达１：５１２００和１：５×１０￣６，特异性较强。经间接双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测ＧＦＶ提纯病毒最低浓度为３ｎｇ／ｍｌ。对葡萄的根、幼叶和嫩茎抽提液检测结果一致，稀释倍数１：２０。

甘肃葡萄扇叶病毒和卷叶病毒的检测

采用 DAS-ELISA 检测方法对甘肃地区的葡萄主要品种进行扇叶病毒和卷叶病毒的调查和测定。结果表明,这两种病毒病在甘肃地区的主要葡萄产区均有发生。兰州地区和一些老的葡萄产区葡萄带病毒病较严重。通过对比植株下部枝条的幼叶、幼茎、老叶和老茎病原的检测结果,说明植株下部幼嫩组织是卷叶病毒最适的检测部位。

葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因克隆和植物表达载体的构建

用RT-PCR法从葡萄扇叶病毒杭州分离物(GFLV-H)基因组RNA中扩增了该病毒分离物的外壳蛋白基因cDNA片段,并克隆到质粒pGEM-T-easyVector.序列分析结果表明,该基因含有1515个核苷酸,编码504个氨基酸,其核苷酸和推导的氨基酸与GFLV法国分离物F13的同源性分别为88%和95%.目前该基因已成功地克隆到植物表达载体pBI121,经三亲交配导入到根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404中.

葡萄扇叶病毒杭州分离物(GFLV-H)P_(38)蛋白基因克隆及序列分析

为了证实GFLV-HP38蛋白的性质及其在寄主扩散中的作用,根据葡萄扇叶病毒(Grapevinefanleafvirus,GFLV)法国分离物F13RNA2序列合成特异性引物,利用RT-PCR从GFLV-H基因组中扩增出P38蛋白基因的cDNA片段,并克隆到pGEM-T-easyvector上。序列分析表明该基因包含1044个核苷酸,编码347个氨基酸。序列比较发现GFLV-HP38蛋白基因与GFLV-F13对应基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为90%和96%;与线虫传多面体病毒属中的南芥菜花叶病毒(Arabismosaicvirus,ArMV)和番茄环斑病毒(Tomatoringspotvirus,TomRSV)对应基因氨基酸同源性分别为85%和38.6%,与烟草黑环病毒(Tabaccoblackringvirus,TBLV)、葡萄铬色花叶病毒(Grapevinechromemosaicvirus,GCMV)和树莓环斑病毒(Raspberryringspotvirus,RRSV)的同源性均低于30%。

应用RT-PCR技术检测葡萄扇叶病毒的研究

以扇叶病株为材料 ,根据病毒外壳蛋白核苷酸序列 ,设计特异引物P1(10 6 4 10 83) ,P2 (76 2 781) ,建立了以RNA为模板的GFLV的RT

北京地区葡萄扇叶病毒检测

采用酶联免疫吸附技术（ＥＬＩＳＡ）（Ａ－蛋白夹心法）对北京地区的葡萄品种进行扇叶病毒（ｆａｎｌｅａｆｖｉｒｕｓ）的测定。结果表明，北京地区葡萄品种普遍感染扇叶病毒且带毒情况较为严重。

三种ELISA方法检测葡萄卷叶病毒(GLRaV)和扇叶病毒(GFLV)的比较

检测是认识一种病害最基本的前提,通过对三种ELISA检测GLRaV和GFLV的比较认为,双抗夹心-ELISA(DAS-ELISA)、间接-ELISA(PTA-ELISA)和A蛋白夹心-ELISA(PAS-ELISA) 都能检测GLRaV和GFLV。DAS-ELISA能缩短检测的时间,然而这项技术具有较高的株系特异性,在检测中可能产生假阴性反应,因此,必要时可用PTA-ELISA和PAS-ELISA对一些关键样品进行复检。

葡萄茎尖组培苗中扇叶病毒的酶联(ELISA)检测

目前使用的扇叶病毒(GFLV)检测方法包括:接种昆诺藜与千日红、嫁接接种砂地葡萄(Vitis rupestris Scheele)的St.George 品种、免疫双扩散,抗体致敏乳胶试验、免疫电镜及酶联免疫吸附试验(ELISA)。(ELISA)方法由于无需特殊设备,从而得到最广泛应用。在植株体内,GFLV 的含量随季节而变化。在某些时期,含量很低,即使用ELISA,也无法测出其中的 GFLV。

葡萄扇叶病毒和卷叶病毒的田间病状鉴别与防治

扇叶病毒和卷叶病毒是我国葡萄生产中的主要病毒种类,一些新发展地区由于对病毒的危害认识不够,盲目引种,已造成了酿酒企业和果农的严重经济损失。本文介绍了两种病毒的田间病状、与其易混淆的病害现象和传播途径,并提出了防治方法。

葡萄扇叶病毒病的田间观察

随着葡萄栽培业的发展和植保专业科学技术的提高,葡萄病毒病已引起专业人员的高度重视。但目前国内尚未研究出其病原物,更没有大面积防治的先例。扇叶病毒病发生初期往往被误认为是生理病或缺素症。它是由苗木本身(或地块以前有病原物)带有病毒,定植在葡萄园中,再由线虫和花粉传播造成大面积感染。为了今后对其更好的识别和研究,我们在1988—1990年,对同等栽培条件下的扇叶病毒病植株和正常植株的生长表现,结果习性等进行了比较观察,初步得出一些形态特征,在此供献给生产者和研究者参考。

我国葡萄扇叶衰退病相关病毒研究进展

葡萄扇叶衰退病(grapevine fanleaf degeneration disease,GFDD)是葡萄栽培中常见的病毒病害,在我国葡萄产区发生普遍,危害严重。引起该病的病毒种类有10余种,症状表现受葡萄品种、病毒种类、栽培条件等多种因素影响。由于高通量测序技术的发展与应用,我国鉴定发现了除葡萄扇叶病毒(grapevine fanleaf virus,GFLV)之外的3种GFDD相关病毒,即葡萄浆果内坏死病毒(grapevine berry inner necrosis virus,GINV)、灰比诺葡萄病毒(grapevine Pinot gris virus,GPGV)和葡萄蚕豆萎蔫病毒(grapevine fabavirus,GFabV)。系统综述了我国GFDD的主要病原及其侵染状况,可为该病害的精准防控提供参考。