扇贝毒素pectenotoxins(PTXs)研究进展

扇贝毒素(pectenotoxins,PTXs)是一类聚醚大环内酯结构的脂溶性海洋生物毒素,是由海洋甲藻中的鳍藻属Dinophysisspp.的几个种产生的,1984年首次从日本的养殖扇贝Patinopecten yessoensis中发现鉴定,具有很高的小鼠腹腔注射致死毒性。近年发现的地理区域不断扩大,我国尚属空白。就这一毒素的结构、来源生物、毒性、携带生物、地理分布、降解代谢及风险评估等研究现状作一系统综述,并分析展望了今后我国藻毒素研究的重点方向。

栉孔扇贝对麻痹性贝类毒素的生理响应及转录组分析

本研究将栉孔扇贝(Chlamys farreri)暴露于塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense),通过测定内脏团中毒素的蓄积含量、氧化应激酶活性及其基因转录调控变化,探究栉孔扇贝暴露于麻痹性贝类毒素(Paralytic shellfish toxin,PSTs)的初期应激响应机制。结果显示,PSTs在内脏团中迅速蓄积,实验第6天时毒素含量最高,实验第30天时毒素残留量高达62.4%;PSTs引发栉孔扇贝体内脂质过氧化,过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)显著应激(P<0.05)。透射电镜下观察组织病变,发现空泡化、染色质聚集和核质固缩等结构损伤。通过加权基因共表达网络分析鉴定细胞凋亡和谷胱甘肽代谢解毒通路显著应激上调,映射ALOX5、Af GST-σ11、caspase-8及Bax 4个关键转录因子。综上可知,除抗氧化应激外,栉孔扇贝可激活特征性细胞凋亡和以谷胱甘肽解毒代谢反应抵抗PSTs毒性作用。本研究可为深入探索栉孔扇贝应激与代谢PSTs的特征机制提供科学依据。

液相色谱-串联质谱法同时测定贝类中大田软海绵酸、鳍藻毒素、蛤毒素和虾夷扇贝毒素

建立了同时测定贝类中大田软海绵酸(okadaic acid,OA)及其衍生物鳍藻毒素(dinophysistoxin-1,DTX-1)、蛤毒素(pectenotoxin-2,PTX-2)和虾夷扇贝毒素(yessotoxin,YTX)的液相色谱-串联质谱分析方法。样品经甲醇提取,固相萃取柱净化,C18色谱柱分离,经含甲酸和甲酸铵的乙腈-水溶液为流动相梯度洗脱,选择反应监测(SRM)模式检测,正、负离子切换扫描,基质标准校正,外标法定量。结果表明,OA、DTX-1和YTX的线性范围为2.0～200.0μg/L,定量限(以信噪比(S/N)≥10计)为1.0μg/kg;PTX-2的线性范围为1.0～100.0μg/L,定量限为0.5μg/kg;几种化合物的添加平均回收率为83.1%～105.7%,相对标准偏差(RSD)为3.16%～9.29%。成功应用本法对黄海灵山湾海域采集的贝类样品进行了分析,发现部分样品中含有大田软海绵酸、鳍藻毒素、蛤毒素和虾夷扇贝毒素。

虾夷扇贝毒素yessotoxins(YTXs),中国沿海贝类中首次发现的一组贝类生物毒素

采用高效液相色谱-串联质谱方法对我国近海贝类中腹泻性贝毒成分进行研究,结果发现采自北黄海大连附近海域的海湾扇贝和虾夷扇贝含有25~41μg/kg的虾夷扇贝毒素（yessotoxin,YTX）,在虾夷扇贝体内还含有37.2μg/kg的45-OH-YTX,并在5种贝中发现微量的Homo-YTX毒素组分,这是首次报道在我国贝中检出此类毒素。虾夷扇贝毒素YTXs是一类含有2个磺酰基的脂溶性多环聚醚类化合物,对小鼠的腹腔注射急性致死毒性很高,毒理作用机制尚不清楚。本研究的结果说明我国贝类体内生物毒素成分复杂,亟需进行毒素成分结构、来源生物、生态毒理效应、分布规律及安全限定标准的研究。

扇贝中麻痹性毒素的提取与分离纯化

为了获得麻痹性毒素标准品,以毒化扇贝为试验材料,对扇贝中的麻痹性毒素(PSP毒素)进行了提取和分离纯化。以酸性80%乙醇溶液反复提取麻痹性毒素,得到了总毒性为6170MU的毒素粗提液。毒素粗提液经过超滤、Bio-GelP-2凝胶柱层析和Bio-Rex70离子交换柱层析等二次层析柱分离纯化后得到以膝沟藻毒素群(GTXs)为主的纯化PSP毒素。HPLC分析结果显示,扇贝中主要含有膝沟藻毒素GTX3,GTX1、GTX2、GTX3、和GTX4的组成比例约为2∶4∶14∶1(以HPLC上的峰面积比例计)。纯化后的毒素可以作为标准物质用于GTX1-4的HPLC分析。

北黄海海域虾夷扇贝体内脂溶性藻毒素分析

海洋中有毒藻类产生的藻毒素能够经由食物链在滤食性贝类体内累积,危及人类健康。高效液相色谱-串联质谱联用技术(HPLC-MS/MS)可以对多类脂溶性藻毒素进行同步分析,是贝类中脂溶性藻毒素检测的首选方法。本文应用液-质联用方法,对北黄海虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)中的脂溶性毒素进行了分析。虾夷扇贝样品于2011年采自北黄海海域,并解剖为闭壳肌、外套膜、内脏团和性腺四部分。在虾夷扇贝中共检测到大田软海绵酸(Okadaic acid,OA)、鳍藻毒素-1(Dinophysis toxin 1,DTX1)、扇贝毒素-2(Pectenotoxin 2,PTX2)和虾夷扇贝毒素(Yessotoxin,YTX)四种脂溶性毒素成分。在扇贝各组织中,内脏团毒素含量最高(OA:1.97—2.99μg/kg;DTX1:4.97—77.29μg/kg;PTX2:1.12—50.08μg/kg;YTX:825—6680μg/kg),其次是性腺和外套膜,闭壳肌中毒素含量最低。各组织之间的毒素组成情况没有明显差异,均以YTX含量最高,占脂溶性藻毒素总含量的90%以上。除YTX外,扇贝体内还存在一定量的OA、DTX1和PTX2毒素,虾夷扇贝中检出PTX2在我国系首次报道。北黄海海水样品中存在较高密度的渐尖鳍藻(Dinophysis acuminata)和倒卵形鳍藻(D.fortii),可能是虾夷扇贝体内OA,DTX1和PTX2的潜在来源。为防范虾夷扇贝中藻毒素造成危害,应进一步强化对北黄海海域贝类中藻毒素及海水中有毒藻类的监测。

氮杂螺环酸毒素在栉孔扇贝体内的代谢规律

氮杂螺环酸毒素(azaspiracids,AZAs)隶属八大类海洋贝类毒素,为一类含氮且具独特螺环结构的聚醚类毒素。采用液相色谱-三重四级杆复合离子阱质谱,研究了分离自中国近海的1株氮杂螺环酸产毒藻腹孔环胺藻(Azadinium poporum,AZDY06)所产氮杂螺环酸毒素在栉孔扇贝体内的蓄积、分布和生物转化机制。通过将栉孔扇贝暴露产毒藻的方式,分析扇贝内脏团、裙边、闭壳肌和其他可食组织4个组织部位的AZAs及其代谢产物分布,研究栉孔扇贝对毒素的代谢机理。结果表明,AZDY06主要产生AZA2毒素,单细胞产毒能力最高为(7.05±0.52)fg/cell;扇贝12 h内摄食5×10~7个产毒藻细胞后,体内AZAs毒素含量已超欧盟安全限量,达165.3μg AZA1eq/kg,蓄积效率为78.2%。AZAs毒素在扇贝各组织间分布存在显著差异:内脏团>其他可食组织>外套膜>闭壳肌。AZA2在扇贝中潜在转化方式为羟基化、去羧基化和氧化,共生成4种代谢产物:AZA6、AZA12、AZA19和AZA23,其中AZA19为最主要代谢产物,约占总毒素40%,其他代谢产物含量较低。本研究证明中国近海分布氮杂螺环酸产毒藻毒性危害较强,建议有关部门加快制定AZAs限量标准。

虾夷扇贝毒素对ICR小鼠小脑浦肯野细胞毒性作用的初步研究

以雌性ICR小鼠为研究对象,尾静脉注射虾夷扇贝毒素24h后处死,通过脑组织切片,苏木精伊红染色、甲苯胺蓝染色以及钙结合蛋白S-100免疫染色,研究了虾夷扇贝毒素对小鼠浦肯野细胞的毒性作用。结果表明,尾静脉注射虾夷扇贝毒素的小鼠小脑浦肯野细胞细胞质有明显变化,同时在光学显微镜下观察到细胞核有收缩而用钙离子结合蛋白S-100的免疫荧光染色结果表明,虾夷扇贝毒素作用后,小鼠浦肯野细胞的S-100蛋白表达增多,而其他组织则没有明显变化。浦肯野细胞形态学以及细胞内钙离子结合蛋白的变化说明虾夷扇贝毒素可能对神经细胞有毒性作用。

虾夷扇贝毒素对Hela细胞凋亡诱导作用的初步研究

以Hela细胞为研究对象,通过四氮唑蓝(MTT)比色法、光学显微镜观察、Giemsa染色以及DNA凝胶电泳,研究了几种产YTXs的赤潮藻种多边舌甲藻(Lingulodinium polyedrum)CCMP1931,具刺膝沟藻(Gonyaulax spinifera)CCMP409,网状原角藻(Protoceratium reticulatum)CCMP2776粗提液对细胞的凋亡诱导作用,并通过LC-MS/MS分析各粗提液的成分及毒性大小。结果表明:CCMP1931、CCMP409、CCMP2776均对Hela细胞有毒性作用,能引起细胞凋亡事件,同时,分析其毒素成分发现,3种藻均能产生YTX及其衍生物,且相对毒力大小为CCMP2776>CCMP1931>CC-MP409。

虾夷扇贝毒素对Hela细胞凋亡的诱导及胞内钙离子浓度的影响

通过MTT分析、光学显微镜观察、Hoechst33342染色质荧光染色、DNA琼脂糖凝胶电泳、罗丹明123染色及钙离子激光扫描显微镜检测等手段,分析了虾夷扇贝毒素(yessotoxin,YTX)对Hela细胞的毒性作用。通过实验发现,正常Hela细胞与不同浓度YTX共孵育24 h后,一定浓度的YTX能对Hela细胞产生毒性作用,使其发生明显凋亡特征,如形态变化、染色质凝缩、DNA片段化以及线粒体膜电位降低。此外,YTX还能造成Hela细胞内胞质钙离子升高。这种毒性作用可能是YTX通过对胞内钙离子浓度的影响进而诱导发生的。

准静态扫集胶束电动毛细管色谱法测定扇贝样品中的贝类毒素

采用准静态扫集胶束电动毛细管色谱(MEKC)法测定了扇贝样品中的2种贝类毒素。毛细管内首先充满含十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲溶液,调节缓冲溶液的pH值,使电渗流等于SDS胶束的电泳流速,电动进样时,带正电荷的贝类毒素离子被SDS扫集吸附,由于SDS在毛细管内处于准静止状态,可使进样时间延长至320 s。与常规电动进样MEKC相比,石房蛤毒素和软骨藻酸的检测灵敏度分别提高950和810倍。该方法对石房蛤毒素和软骨藻酸的检出限分别为0.05,0.12 ng/m L。方法可实现对扇贝样品中2种贝类毒素的快速、灵敏检测。

麻痹性贝类毒素在栉孔扇贝体内的代谢轮廓

将栉孔扇贝(Chlamys farreri)直接暴露于产毒藻,通过比较各组织器官中毒素的蓄积及代谢转化特征,研究麻痹性贝类毒素(Paralytic Shellfish Toxins,PSTs)在栉孔扇贝体内危害形成的过程。结果显示,分布于中国的一株塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense,AT5-3株),其生长及产毒性状稳定,产毒能力强,主要成分为Gonyautoxins-1&-4(GTX1&4),单细胞产毒能力为7.95 fmol/cell;栉孔扇贝对该产毒藻具有较强摄食能力及PSTs蓄积能力,总体蓄积效率达到84.4%,最高蓄积浓度为1903μg STX eq./kg,不同组织蓄积能力由高到低依次为内脏团、性腺、外套膜、闭壳肌;内脏团对PSTs的代谢能力也最强,是该毒素在栉孔扇贝体内蓄积代谢的靶器官;此外,栉孔扇贝对PSTs表现出较强的生物转化能力,主要转化途径为:N-磺酰胺甲酰基类毒素(N-Sulfocarbamoylgonyautoxin-2,C1)→膝沟藻毒素(Gonyautxins-2,GTX2)/脱氨甲酰基类毒素(Decarbamoylgonyautoxins-2,dc GTX2),N-磺酰胺甲酰基类毒素(N-Sulfocarbamoylgonyautoxin-3,C2)→膝沟藻毒素(Gonyautxins-3,GTX3)。本研究中,栉孔扇贝对PSTs总体呈现出迅速蓄积和缓慢代谢的特点,同时,GTX1&4和NEO等高毒成分所占比例较高,造成扇贝中PSTs毒性和风险性均显著升高。本研究有助于科学评估PSTs危害的形成机制,为系统监控我国PSTs风险性提供科学支撑。

虾夷扇贝毒素(yessotoxin)诱导的栉孔扇贝(Chlamys farreri)体内P糖蛋白转运活性及其分布研究

大量研究表明P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)介导的多型异源物质抗性机制(multi-xentiobiotic resistance,MXR)在贝类耐受或抵抗污染水域中有毒有害物质的毒害中具有重要作用,但是该机制在贝类抵抗或耐受食源性毒素方面作用的研究却很少。本研究以栉孔扇贝(Chlamys farreri)为实验动物,向其投喂产虾夷扇贝毒素(yessotoxins,YTXs)的网状原角藻(Protoceratium reticulatum),通过检测栉孔扇贝鳃和消化腺组织中YTX毒素含量随时间的变化情况,结合2种组织中P-gp介导的MXR活性变化及P-gp在组织中的表达和分布,探讨P-gp在扇贝耐受YTX毒素中可能的作用。研究结果表明,随着毒藻暴露时间的延长,栉孔扇贝鳃和消化腺中YTX含量逐渐增加,且具有明显的时间依赖关系。YTX的大量累积虽未导致扇贝死亡,但是仍然对扇贝组织产生不同程度的毒性。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色发现,染毒12 h后,栉孔扇贝鳃组织前端出现明显黑化,消化腺组织导管上皮细胞部分脱落入管腔中,腺管内细胞界限模糊,部分腺管崩解。罗丹明B(rhodamine B,Rho B)外排实验表明YTX毒素暴露能显著增强栉孔扇贝鳃和消化腺组织中P-gp的转运活性,暴露12 h后鳃和消化腺Rho B的排出速率就已分别达到对照组的3.8倍和1.4倍,随着暴露时间的延长,P-gp活性略有增强,72 h后开始下降;P-gp的功能性抑制剂维拉帕米(verapamil,VRP)在实验设定的浓度下没有抑制反而增强了Rho B的外排;免疫定位显示,毒素暴露后栉孔扇贝鳃丝前端纤毛柱状细胞及消化腺导管上皮柱状细胞和腺管消化细胞P-gp免疫阳性信号增强,说明YTX毒素暴露提高了P-gp的表达量。综上推断,YTX毒素可能是P-gp的底物,它能够诱导P-gp转运活性增强,并增加P-gp的表达量来参与扇贝对YTX毒素的耐受或抗性;设定浓度的VRP不能抑制P-gp的活性,这可能是由于种属差异造成的,关于VRP对栉孔扇贝Pgp的作用还有待进一步的研究。

基于高效液相色谱法的扇贝毒素-2制备方法研究

本文以渐尖鳍藻(Dinophysis acuminata)为实验原料,建立了基于高效液相色谱法(HPLC)的扇贝毒素-2(Pectenotoxin-2,PTX2)的制备方法。研究重点对鳍藻细胞的破碎、PTX2毒素的提取及HPLC纯化等三个步骤的方法进行筛选和优化。结果表明,反复冻融与超声波细胞破碎相结合可获得最大的细胞破碎率和毒素提取率,分别为99.2%和81.5%。采用四种有机试剂(甲醇、丙酮、乙醚、二氯甲烷)及三种固相萃取小柱(Solid Phase Extraction,SPE)(Oasis HLB SPE,Phenomenex Strata-X SPE,Sep-Pak C18 SPE)对PTX2毒素进行提取,其中乙醚-二氯甲烷的提取效率最高,达78.2%。在HPLC对PTX2毒素的纯化实验中发现,流动相的pH会影响毒素组分的分离,其中在碱性流动相(含6.7mmol/L氨水的水溶液和乙腈溶液,pH=10.94)条件下,PTX2的分离效果最佳,响应值最高。实验使用Phenomenex Kinetex C18(4.8mm×250mm,5μm)色谱柱,在上述碱性流动相条件下,分离得到纯度为93.2%的PTX2毒素。本研究选定的藻细胞破碎、PTX2毒素提取、及HPLC纯化方法简单快捷,高效易操作,为从大规模培养的鳍藻细胞中制备高纯度PTX2毒素提供了技术支持。

栉孔扇贝对氮杂螺环酸毒素代谢解毒的生理应激响应

将栉孔扇贝(Chlamys farreri)暴露于分离自我国近海的一株氮杂螺环酸毒素(azaspiracids,AZAs)产毒藻——腹孔环胺藻(Azadinium poporum,AZDY06株,主产AZA2),研究了栉孔扇贝对AZAs的代谢解毒效应以及代谢过程中血细胞数量、抗氧化酶活性及细胞超微结构变化等生理应急响应。结果发现,栉孔扇贝对AZDY06所产的AZA2具有一定的代谢解毒能力,可将AZA2转化成AZA6、AZA12、AZA19和AZA23等4种极性较强且毒性较低的代谢产物。代谢解毒过程中,栉孔扇贝血细胞数量、关键抗氧化酶活性及靶器官细胞超微结构均出现一定的应激效应,且总体表现出明显的剂量-效应关系。栉孔扇贝血细胞数量对AZAs表现出较强的应激反应,且随实验过程出现较大波动,最高可达对照组的2—3倍;抗氧化系统酶如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化物酶(POD)和酸性磷酸酶(ACP)活性也出现不同程度的变化:GSH-Px与POD在整个蓄积代谢过程中均表现出持续激活状态,且血液中这两种酶活性最高,可达内脏和鳃中的20倍以上;SOD活性与扇贝中AZAs含量有一定关系,AZAs含量为74.2—168.2μg AZA1 eq/kg时为诱导状态,过高或过低剂量均表现为抑制效果;而ACP对AZAs的应激表现也十分敏感,但代谢过程中大部分时间为被持续抑制状态。此外,AZAs还导致栉孔扇贝内脏和鳃细胞超微结构出现空泡化、核固缩等病理性变化;实验后期,低暴露组细胞结构出现一定的自我修复现象,而高暴露组则无此现象。本研究可为进一步深入探索AZAs的解毒机制,对其进行风险评价并制定限量标准提供科学依据。

液相色谱-高分辨质谱测定贝类中虾夷扇贝毒素

[目的]建立贝类产品中虾夷扇贝毒素(YTX)的液相色谱-四极杆-静电轨道场离子阱高分辨质谱检测方法。[方法]以牡蛎和文蛤为研究对象,样品经甲醇提取,采用QuEChERS净化,经Hypersil GOLD C 18色谱柱分离,乙腈和0.002 mol/L甲酸铵溶液(含0.2%甲酸)为流动相梯度洗脱,负离子全扫描+数据依赖二级扫描,提取一级谱图中准分子离子精确质量数定量,二级质谱图中特征离子精确质量数定性。[结果]虾夷扇贝毒素(YTX)在12 min内出峰,定量限为0.3μg/kg,在9.05~181.00μg/L范围内线性良好,相关系数r=0.9964,回收率96.3%~102.8%,相对标准偏差(RSD)小于14.2%(n=6)。[结论]该研究为贝类毒素监控提供了技术支持。

扇贝样品检出麻痹性毒素超标 近期慎吃扇贝

深圳市疾控中心发布贝类食品贝类毒素检测情况报告,有样品毒素超标近6倍近期别吃扇贝。近期,港澳等地相继发生了市民食用鲜带子中毒事件。昨日,市疾控中心发布近期监测的贝壳类水产品的检测情况报告,两份扇贝样本中验出含有麻痹性贝类毒素,其中一份扇贝样本所验出的麻痹性贝类毒素为473.1μg/100g,比联合国卫生组织的安全警示线80μg/100g,高出了近6倍。

大亚湾和大鹏湾麻痹性贝类毒素动态分析

于 1 997～ 1 999年在大亚湾和大鹏湾的主要贝类养殖区设立了四个采样点 ,以华贵栉孔扇贝和翡翠贻贝为对象逐月采样 ,用美国分析化学家协会推荐的生物测定法进行麻痹性贝类毒素测定。结果显示 ,1 999年 1月～ 1 999年 6月大亚湾东山海域的扇贝消化腺毒素含量为 1 2 63～ 1 0 5Mu/g ,剔除消化腺后的其他软组织毒素含量为 1 3 4至低于 1 7Mu/g ,消化腺和其他软组织毒素含量的加权平均值为 7 7～ 1 1 7Mu/g ,高于联合国粮农组织制定的贝类安全食用标准的限定值 4Mu/g ,尤其是 1月份 ,超过限定值近 30倍。同期该样点的贻贝消化腺毒素含量为 0～ 567Mu/g ,剔除消化腺后的其他软组织毒素含量为 0～ 1 4 2Mu/g ,消化腺和其他软组织毒素含量的加权平均值为 0～ 72 8Mu/g ,仅在 1月份贻贝毒素含量超标。总体上贝毒含量表现为由冬春季高峰期逐月波动下降的趋势。大亚湾澳头海域的两种贝类毒素含量都不高 ,扇贝长期含有较低的毒素 ,贻贝在大部分时间内不含毒素 ,仅在 1 998年 5月间 ,出现一低于 3 5Mu/g的高峰期。大鹏湾南澳海域的两种贝类毒素含量不高 ,贻贝毒素含量均低于生物测定法极限值 ,而扇贝消化腺毒素含量仅 1 998～ 1 999年冬季略有超标。本文还就麻痹性贝毒的分布与贝类种类、时空间的关系进行?