豚鼠鼻黏膜纤毛细胞的手工显微分离

目的:由于呼吸道纤毛取材困难,并且生长在较厚的黏膜上,透光性较差而难以进行直接观察,因此人们尝试用不同的方法获取纤毛细胞。实验拟将手工显微分离技术应用于豚鼠鼻黏膜纤毛细胞的分离,为进一步实验提供纯净的目的细胞。方法:实验于2007-03/11在解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科研究所完成。白色健康豚鼠20只,在显微镜下用显微器械将豚鼠鼻黏膜的纤毛细胞层和黏膜下层进行分离,取手工显微分离的黏膜和未行分离的全层黏膜行苏木精-伊红染色,明确所分离组织层是否为黏膜纤毛细胞层。再将纤毛细胞层酶解,低倍镜下观察单个鼻黏膜纤毛细胞个数,纤毛细胞团大小,杂质细胞多数。高倍镜下观察纤毛细胞的形态。结果:苏木精-伊红染色见手工显微分离的组织层为纤毛细胞和基底细胞层,较薄,不含有黏膜下层。低倍镜下可见手工显微分离后纤毛细胞较密集,单个鼻黏膜纤毛细胞较多,纤毛细胞团较小,每个细胞团平均有7个纤毛细胞左右,且纤毛细胞团下面无其他细胞。高倍镜下可见手工显微分离的单离纤毛细胞膜光滑,折光性好,纤毛摆动活跃,存活时间明显延长,24h仍有50%存活。与传统分离技术相比,手工显微分离技术在目的细胞纯度和活性上有显著优势(P<0.05)。结论:将手工显微分离技术应用于纤毛细胞分离和纯化降低了杂质细胞干扰,提高了细胞活性,满足了提供纯净目的细胞的实验要求。

单个淋巴细胞的手工显微分离与单细胞RT-PCR研究

目的建立单个T淋巴细胞的手工显微分离与目的基因扩增方法,为基于单个T淋巴细胞的相关研究奠定基础。方法利用倒置显微镜和自制玻璃毛细管对T淋巴细胞进行手工单细胞显微分离,并针对T淋巴细胞个体小、胞质少的特点优化反转录与PCR条件,实现单个T淋巴细胞水平的反转录与目的基因扩增。结果有效地对单个T淋巴细胞进行了手工显微分离,优化了单细胞的反转录和PCR条件,成功扩增出看家基因和多个特定目的基因,在此基础上又对TCR基因进行了扩增。结论所建立并优化的手工显微单细胞分离技术与单细胞RT-PCR技术能有效地从单个T淋巴细胞中扩增目的基因,为今后基于单细胞水平研究高度异质性T细胞的功能、特性奠定了基础。

外周血单个淋巴细胞遗传分析及其在遗传性疾病诊断中的应用

目的建立以外周血单个淋巴细胞遗传分析为基础的遗传病诊断方法,为基于单细胞遗传分析实现遗传病诊断的研究奠定基础。方法健康者、遗传病基因携带者外周血经淋巴细胞分离液,连续稀释处理后在体视镜下采用自制装置分离单细胞,对分离细胞行全基因组扩增(WGA)并利用目的基因一代测序评估其对于遗传病的诊断价值。结果该研究实现了β-珠蛋白生成障碍性贫血、法布里病、先天性肾病综合征的准确诊断。结论本研究的单细胞分离技术可快速地分离出单个淋巴细胞,与单细胞WGA联合能够实现遗传性疾病的准确诊断,为开展单细胞水平的遗传研究提供了思路。