反义托品酮还原酶Ⅱ基因对三分三的遗传转化及生物碱含量测定

[目的]通过反义托品酮还原酶Ⅱ基因提高托品酮还原酶I(TRI)的表达水平,从而增加莨菪碱在三分三中的含量,为大规模开发生产托品烷生物碱提供理论基础。[方法]将携带反义托品酮还原酶Ⅱ基因的重组工程菌C58C1-p1304+-antTRⅡ采用叶盘法对三分三进行遗传转化。潮霉素筛选转基因发根,PCR检测转基因发根基因组中是否同时含有rolB、rolC和Hygr抗性基因。PCR阳性转基因发根扩大培养后,提取生物碱,并采用高效液相色谱法进行生物碱含量测定。[结果]共有9个转基因发根的基因组同时检测到rolB、rolC和Hygr抗性基因,且这9个转基因发根中的莨菪碱含量较对照有不同程度的提高。[结论]反义托品酮还原酶II基因对托品烷生物碱代谢途径起到一定程度的正调控作用。

霍山石斛托品酮还原酶基因的克隆及其表达分析

为了探究托品酮还原酶(tropinone reductase,TR)基因在石斛中的功能,该研究采用RT-PCR结合RACE技术,以霍山石斛原球茎为材料,克隆得到霍山石斛TR-I基因的cDNA序列,其在Gen Bank中的登录号为KY912085。TR-I基因的cDNA长1 043 bp,包含一个完整的共807 bp的ORF(open reading frame)(79-885),共编码268个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白质可能是一种疏水性稳定蛋白质,无信号肽,不含卷曲螺旋结构,具有14个功能位点、47个潜在磷酸化位点,其二级结构由螺旋、折叠和卷曲结构组成。系统进化树分析表明,霍山石斛TR-I与铁皮石斛、金钗石斛的亲缘关系较近,处于同一分支。qPCR结果显示,TR-I基因在霍山石斛不同生长期的相对表达量均表现为茎>叶>根,且茎和叶中TR-I的表达量均随着生长期的延长呈现低–高–低的变化趋势;在不同品种中,金钗石斛的TR-I基因相对表达量最高,铁皮石斛中最低;不同浓度茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)处理比较,100μmol/L茉莉酸甲酯处理下TR-I基因表达量最高,推测该基因可能参与霍山石斛生物碱的合成途径。

颠茄PMT·TR-I和H6H基因植物高效表达载体的构建

[目的]构建1,4-丁二胺-氮-甲基转移酶(Putrescine N-methyltransferase,PMT)基因、托品酮还原酶-I(Tropinone reductase-I,TR-I)基因和莨菪碱6-β-羟化酶(Hyoscyamine 6β-Hydroxylase,H6H)基因的植物高效表达载体。[方法]采用RT-PCR方法从颠茄中克隆到PMT、TR-I和H6H基因编码区序列,并连接到植物表达载体pCAMBIA1304+(p1304+)中。[结果]成功构建了植物高效表达载体p1304+-PMT、p1304+-TR-I、p1304+-H6H、p1304+-PMT-H6H、p1304+-TR-I-PMT和p1304+-TR-I-H6H,并转化农杆菌,获得可直接用于遗传改良颠茄的工程菌。[结论]该研究为利用植物基因工程技术提高东莨菪碱的产量奠定了基础。

木本曼陀罗中一条新的TRI基因克隆与酶活功能鉴定

托品酮还原酶I(tropinone reductase I, TRI)是托品烷生物碱(tropane alkaloids, TAs)合成途径中游分支点处的关键酶,可引导托品酮代谢流进入TAs合成,因此是TAs代谢工程重要的靶标基因。本研究从木本曼陀罗(Datura arborea)中克隆到了一条新的TRI基因,命名为DaTRI2 (GenBank登录号为MH705164)。DaTRI2基因cDNA全长1 135 bp,与DaTRI序列一致性为96.8%,预测编码272个氨基酸。DaTRI2蛋白具备茄科TRI保守的结合NADPH的TGXXXGXG基序、结合底物托品酮的11个保守氨基酸残基以及发挥催化活性的N-S-Y-K四联体基序。进化关系上, DaTRI2和茄科的TRI成员聚为一支,与Datura属的TRI亲缘关系最近。对DaTRI2进行原核表达,纯化的重组蛋白能催化托品酮还原反应和托品氧化反应,最适pH值分别为8.0和9.6。DaTRI2在pH=6.4时,对托品酮的Km和Vmax分别为210.05μmol·L^(-1)和69.6 nkat·mg^(-1) protein,在pH=9.6时,对托品的K_m和V_(max)分别为188.03μmol·L^(-1)和114 nkat·mg^(-1) protein。qPCR检测表明DaTRI2在幼叶中表达量最高,其次是须根。DaTRI2基因的克隆和酶活力分析为深入研究木本植物中TAs的生物合成分子机制奠定了基础,同时为TAs代谢工程提供了一个更高效的候选靶基因。