靶向CD99的CAR-T细胞扩增优化研究

背景与目的:嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞疗法对血液和淋巴系统肿瘤的治疗效果显著,但对实体瘤效果较差,这与靶点选择的因素有关。针对尤因肉瘤(Ewing sarcoma,ES),CD99可作为CAR-T细胞潜在的靶点。由于T细胞自身表达CD99蛋白,靶向CD99的CAR-T细胞存在体外扩增能力有限的问题。本研究旨在通过增加CD99敲低的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)、优化慢病毒转导的感染复数(multiplicity of infection,MOI)、筛选培养CAR-T细胞的培养基及培养容器,以获得CD99 CAR-T细胞制备的最优条件。方法:筛选shRNA序列,提高CD99 CAR-T细胞的扩增能力。采用不同的MOI、培养基和培养容器,分别检测在不同条件下CAR-T细胞的转导效率、细胞存活率、增殖能力、特异性杀伤能力及干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)释放水平等,筛选出最优的细胞制备条件。结果:通过shRNA敲低得到的KO-CD99 CAR-T细胞扩增水平显著高于CD99 CAR-T细胞[(16.40±0.40)vs(6.33±1.53),P<0.01]。转导MOI为0.25~1.0、培养基为OptiVitro时细胞的扩增效果最优。在透气瓶中培养的CAR-T细胞扩增倍数显著高于在培养袋中培养的细胞[MOI=0.25:(50.23±3.32)vs(13.02±4.82);MOI=0.50:(49.96±0.83)vs(18.25±2.88);MOI=1.00:(48.27±5.08)vs(13.16±6.26);P<0.01],且细胞分型更优、特异性杀伤更高。结论:通过shRNA技术得到的KO-CD99 CAR-T细胞可实现稳定扩增。从扩增条件优化结果看,MOI为0.25~1.00,培养基为OptiVitro,培养容器为透气瓶的条件下,KO-CD99 CAR-T细胞可获得更优的扩增能力、更多比例的记忆T细胞,为后续开展CD99 CAR-T细胞治疗ES的临床试验奠定了坚实基础。

石蒜SRAP-PCR扩增体系的建立与优化

以陕西产野生石蒜〔Lycorisradiata (L’Hr.)Herb.〕为材料,通过单因子实验分别研究了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物浓度及Taq DNA聚合酶用量对石蒜SRAP分子标记扩增体系的影响,并对扩增体系进行了优化。优化后的反应体系总体积为10μL,含20ng模板DNA、3.0mmol·L-1Mg2+、0.20mmol·L-1dNTPs、0.4μmol·L-1引物和0.50UTaq DNA聚合酶。运用优化体系对9个石蒜居群的基因组DNA进行扩增,获得的DNA条带清晰,多态性比较丰富。说明SRAP-PCR可用于石蒜属植物的亲缘关系、系统演化、物种鉴别和遗传多样性等领域的研究。

香菇SRAP扩增体系的建立与优化

为了建立稳定的香菇(Lentinula edodes)SRAP(sequence-related amplified polymorphis m,相关序列扩增多态性)分子标记技术体系,以香菇(Lentinula edodes)为材料,采用SDS-CTAB(sodium dodecyl sulfate-cetylri methylammoniumbromide)法提取菌丝体基因组DNA,用琼脂糖检测扩增产物,筛选优化了SRAP扩增条件。可用于香菇SRAP分析的最佳PCR条件为20μL PCR反应体系中,模板DNA25ng,Buffer l×,Mg2+2.5mmol/L,dNTP Mixture0.2mmol/L,引物0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5U。优化后的SRAP体系目标条带增多,重现性好。

濒危植物长叶红砂ISSR扩增条件的优化与引物筛选

对濒危植物长叶红砂(Reaumuria trigynaMaxim)的核基因组DNA进行ISSR扩增条件的优化与引物筛选.利用单因素实验,测试了ISSR-PCR反应体系中模板DNA的含量、引物浓度、Master Mix等因素对反应结果的影响,经过优化实验,建立了长叶红砂ISSR-PCR的最佳反应体系,15μL PCR反应体积包括Mix4.5μL,模板DNA 20 ng,引物0.6μmol/L.利用优化反应体系,从60个ISSR引物中筛选出稳定性好、重复性高的14个引物.对长叶红砂5个种群的85个个体进行扩增,共扩增出110个位点,其中多态位点102个,多态位点百分率为92.73%.长叶红砂ISSR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术进一步研究长叶红砂的遗传多样性奠定了良好的基础.

三种摇蚊幼虫RAPD扩增条件的优化及在昆虫系统发育分析中的应用

为了研究摇蚊科昆虫种群遗传的多样性,以促进对其资源的合理保护,以萨摩亚摇蚊Chironomus samoensisEdwards基因组DNA为模板,对摇蚊幼虫的RAPD扩增条件进行优化,建立了摇蚊幼虫RAPD扩增反应的最佳体系:按照利用优化的RAPD扩增条件进行研究,实验有着良好的重现性。用16个随机引物对3种摇蚊幼虫类群各10个个体进行RAPD扩增,其中萨摩亚摇蚊共扩增出78个条带,多态座位率为41.03%,Shannon遗传多样性指数为0.2570,群体内相似度为0.8730;红裸须摇蚊Propsilocerus akamusi(Tokunaga)共75个条带,多态座位率为44.0%,Shannon遗传多样性指数为0.2472,群体内相似度为0.8731;刺铗长足摇蚊Tanypus punctipennis(Fabricius)共67个条带,多态座位率为41.79%,Shannon遗传多样性指数为0.1943,群体内相似度为0.9066。聚类分析结果表明,刺铗长足摇蚊与红裸须摇蚊的亲缘关系较近。

松属部分种的ISSR-PCR扩增体系优化及鉴别

对松属部分种的ISSR-PCR的反应体系及扩增程序进行优化,并进行种质鉴别。优化的10μL扩增体系为:Taq酶0.5 U,10×Buffer(Mg2+free),dNTP 0.35 mmol/L,Mg2+2.25 mmol/L,20ng DNA,0.8μL引物。扩增程序为:94℃预变性7 min,然后进行40个循环:94℃变性30 s,56℃退火45 s,72℃延伸2 min;最后72℃延伸7 min,4℃保温。从100条UBC系列引物中筛选出5条特异性强、稳定性好的引物UBC823、UBC840、UBC841、UBC855、UBC873,扩增的特异性条带可对松属的7个种进行鉴别。

几种主流恒温扩增技术及其优化策略进展

2019年末爆发的新型冠状病毒(2019-nCoV)疫情严重威胁着人类健康与经济发展,遏制疫情发展的关键是如何准确、快速地完成2019-nCoV病毒检定。虽然2019-nCoV检测主流技术平台为PCR聚合酶链反应,但恒温扩增技术因其无需昂贵设备、操作流程简便、即时检验、结果判读简易可视化等优势,逐步成为某些紧急场景PCR替代技术。本文综述了六种主流恒温扩增技术,即依赖核酸序列扩增、滚环核酸扩增、链置换扩增、解旋酶依赖扩增、重组酶聚合酶扩增、环介导恒温扩增,并从等温核酸扩增原理、优化反应策略及其应用领域进行了阐述。

怀地黄SRAP扩增体系的建立与引物的筛选

为建立适合怀地黄SRAP-PCR分子标记技术体系,通过单因子实验分别研究了DNA模板浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、引物浓度以及dNTP浓度对怀地黄SRAP扩增反应的影响,确立了适合怀地黄SRAP最佳反应体系为:在25μL的反应体系中,模板DNA量20ng/25μL、2.5mmol/LMg2+、0.32μmol/L的上下游引物、0.30μmol/L的dNTP以及2.5UTaq酶,并利用确定的体系从88个引物组合中筛选出12对适合怀地黄SRAP-PCR反应的引物。

分蘖洋葱ISSR-PCR扩增体系的建立

以分蘖洋葱幼嫩叶片DNA为试材,采用单因素试验,对ISSR-PCR扩增体系中的退火温度、模板DNA量、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶含量以及引物浓度等各因素进行优化。结果表明,在反应体系为25μL反应液中,包含DNA模板40 ng(2μL),10×PCR Buffer 3μL,Mg2(+2.5 mmol.L-1)2μL,dNTPs(2.5 mmol.L-1)3μL,引物(5 mmol.L-1)3μL,Taq酶(5 U.μL-1)0.4μL,退火温度为56℃时,分蘖洋葱ISSR-PCR扩增获得最佳效果,初步建立分蘖洋葱叶片最佳ISSR-PCR扩增体系,为ISSR分子标记技术应用于分蘖洋葱种群遗传多样性分析、遗传图谱构建、核心种质资源保存利用等奠定分子生物学的理论基础和技术支撑。

香蕉基因组SRAP反应体系的建立和优化

为建立并优化适于香蕉(Musaspp.)SRAP分析的扩增体系,对影响香蕉SRAP反应的dNTP、Mg2+、模板DNA、引物浓度和Taq酶用量等因素进行优化。确定的优化扩增体系为Mg2+2.5mmol.L-1,dNTP250μmol.L-1,Taq酶1.0U,引物0.5μmol.L-1,模板DNA20ng,10×PCRbuffer2.5μL,在此条件下SRAP扩增香蕉基因组DNA条带清晰,多态性丰富。该体系在29个香蕉基因组中获得较好的扩增结果,可望在香蕉植物起源和进化研究中应用。

均匀设计优化杨属的SRAP-PCR反应体系

采用均匀设计方法,对影响杨属SRAP-PCR体系的MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板浓度等因素分别进行了U16(45)和U12(35)两轮优化,建立了适用于杨属的SRAP-PCR反应体系。在25μL反应体系中,MgCl23.5mmol/L、dNTPs0.20mmol/L、引物0.44μmol/L、TaqDNA聚合酶1.50U、模板浓度28ng/L为最适条件。在此基础上又对退火温度进行了摸索,结果发现,扩增结果对退火温度变化不敏感。最后运用优化体系对杨属3派10个种共16个单株的DNA进行扩增验证,结果获得的DNA条带清晰,多态性比较丰富。说明这一优化的SRAP-PCR反应体系可用于杨属不同种间亲缘关系、系统进化和遗传多样性等方面的研究。

香菇SRAP反应体系的优化

为建立并优化适于香菇(Lentinulaedodes)SRAP(Sequence-related amplified polymorphism,相关序列扩增多态性)分析的扩增体系,通过单因子实验分别研究了dNTP、Mg2+、模板DNA、引物浓度和Taq酶用量对香菇SRAP反应的影响。试验获得的25μL优化扩增体系为Mg2+2.5mmol/L,dNTPs250μmol/L,Taq酶1.5U,引物0.5μmol/L,模板DNA20ng,10×PCR buffer2.5μL,此条件下SRAP扩增香菇菌丝DNA条带清晰,多态性丰富。

怀地黄SRAP分子标记优化体系的建立

为了建立适宜怀地黄的SRAP反应体系,以22个不同类型的怀地黄品种为材料,研究了PCR反应体系的主要成分对SRAP扩增结果的影响。对SRAP反应体系中的DNA模板浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、引物浓度以及dNTP浓度进行了探索,确立的适合怀地黄SRAP反应的体系为:在25μL的反应体系中,模板DNA20ng、2.5mmol·L-1Mg2+、0.32μmol·L-1的上下游引物、0.30mmol·L-1的dNTPs以及2.5UTaq酶。并利用该反应体系对怀地黄22个不同品种进行了SRAP反应,发现不同品种间的DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠,可以用于怀地黄的分子标记研究。

八仙花SRAP反应体系的建立与优化

为建立适合八仙花SRAP-PCR分子标记技术体系,以八仙花栽培品种H.macrophylla‘Lavbla’为材料,通过单因子实验分别研究了模板DNA、dNTPs、Mg2+、Taq酶浓度和引物用量对八仙花SRAP扩增反应的影响,确立了八仙花SRAP分析的最佳反应体系为25μl:模板DNA60ng、Mg2+2.0mmol/L、dNTPs0.7mmol/L、Taq酶0.5U、引物0.7μmol/L×2、10×PCRBuffer2.5μl,该反应条件下八仙花SRAP扩增条带清晰,多态性丰富。

油莎豆SRAP-PCR体系优化及遗传多样性分析

以16份油莎豆种质资源为材料,用改良的CTAB法提取基因组DNA,利用单因素试验和正交试验研究引物浓度、混合酶体积和DNA模板含量3个因素对油莎豆SRAP-PCR扩增结果的影响,以优化其SRAP-PCR体系,并对供试油莎豆种质材料的遗传多样性进行分析。结果表明,混合酶体积对SRAP-PCR反应体系影响最大,引物浓度影响最小;油莎豆SRAP-PCR总体系为15μL时,引物浓度为0.5μmol/L、混合酶体积为10.5μmol/L、DNA模板含量为80 ng的扩增效果最佳。利用最佳扩增体系,从102对引物组合中筛选出30对多态性引物,共扩增出289个多态性位点,平均多态性比率为92.82%。进一步对16份油莎豆种质的遗传多样性进行分析,结果显示其遗传一致度范围为0.60~0.93,遗传距离范围为0.07~0.40,表明供试油莎豆种质资源的遗传背景差异较小;UPGMA聚类结果表明,油莎豆种质资源亲缘关系受油莎豆品种特性和地域的影响。本研究结果可为油莎豆种质资源的多样性评价及鉴定提供方法和技术,并为其遗传育种提供依据。

怀地黄SRAP分子标记体系的建立与DNA指纹图谱的构建

以怀地黄DNA为模板,进行SRAP反应条件的优化及DNA指纹图谱构建,优化的反应体系为:25μL的体积中,模板DNA 20 ng,Mg2+浓度2.5 mmol.L-1,上下游引物各0.36μmol.L-1,dNTPs 0.30 mmol.L-1,Taq DNA酶2.0 U.构建了怀地黄23个品种的DNA指纹图谱,为怀地黄品种鉴定、遗传多样性分析、分子标记辅助育种和质量综合评价等研究奠定了基础.

用热启动加两步改良PCR法探讨载脂蛋白E基因多态性与老年性骨质疏松的关系

目的探索ApoE基因的优化扩增方法及ApoE基因多态性与老年人骨质疏松之间的关系。方法分别用常规PCR法和热启动加两步PCR法,对ApoE基因进行扩增,对比两种方法的扩增效果。收集60岁以上老年骨质疏松组和正常对照组患者血样各100份,采用热启动加两步PCR法对ApoE扩增产物进行测序,将测序结果与GENBANK中ApoE目的片段序列比对结果并分析ApoE基因多态性对骨质疏松影响。结果采用热启动加两步循环法优化ApoE的扩增方法,可以有效提高ApoE的PCR扩增的产率并可减少非特异性扩增。骨质疏松组E4等位基因频率高于对照组(P<0.05)。结论热启动加两步循环法可以有效地优化ApoE的扩增效率和特异性,ApoE4等位基因与老年性骨质疏松可能相关。

ESO-based decoupling control with multi-objective optimization for boiler-turbine unit

A model-assistant extended state observer(MESO)-based decoupling control strategy is proposed for boiler-turbine units in the presence of unknown external disturbance and model-plant mismatch. For ease of implementation, the decoupling compensator is reduced to the proportion integration(PI) decoupler with the frequency domain analysis, where the decoupling error in collusion of uncertainties and disturbances can be estimated by the proposed MESO and then compensated. To decrease the sensitivity of the dynamic error for the decoupling control and fulfill various requirements of constraints, such as safety operation, energy conservation, emission reduction, etc., the plant is transmitted through a scheduled steady state region which is achieved from the optimized reference governor in advance. Simulation results show that the proposed control strategy can well suppress various disturbances including a decoupling error, and multi-objective optimization can meet multiple requirements with the premise of safety production.