利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术检测水稻低直链淀粉含量基因Wx-mq

根据Wx-mq基因存在的单核苷酸变异,利用四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra-primer ARMS-PCR)的方法设计特异引物,对12个水稻品种(或品系)以及武育粳3号(不含Wx-mq基因)/关东194(含Wx-mq基因)的F2分离群体进行扩增,依据其PCR产物的带型,可以准确区分出Wx-mq基因纯合、非Wx-mq基因纯合以及杂合基因型三种类型,其电泳结果与成熟后对胚乳外观特性鉴定完全一致。因此,作为一种简单、低成本的实用技术,四引物ARMS-PCR可以广泛用于Wxmq基因水稻的资源鉴定和分子标记辅助育种。

四引物扩增受阻突变体系PCR快速测定绵羊BMPR-IB基因型方法的建立

四引物ARMSPCR是检测SNP有效、快速、简便的方法。绵羊BMPRIB基因是控制Booroola绵羊多胎性状的主效基因,此研究目的在于建立一种对BMPRIB基因四引物ARMSPCR检测方法。根据四引物ARMSPCR技术原理,在绵羊BMPRIB基因突变位点(A746G)设计一对特异性引物,并在突变点两侧设计一对参照引物,用来扩增含有突变点的DNA片段,可在一步PCR反应中根据电泳图谱准确判断绵羊个体的BMPRIB基因型,对比PCRRFLP检测结果表明,所建立的方法简单,操作简便,大大提高了检测效率。

四引物扩增受阻突变体系PCR技术在中国明对虾SNP基因分型中的研究

采用四引物扩增受阻突变体系PCR（Tetra-primer ARMS-PCR）技术,对中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）的80个单核苷酸多态性位点（Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs）进行验证。结果表明,通过优化PCR反应条件、调整内外引物浓度和采取Touchdown PCR程序可优化扩增效果,80组引物中有20组引物得到良好的分型效果。群体多态性分析表明有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）及多态性信息含量（PIC）的范围分别为1.127~1.993、0.136~0.607、0.119~0.492和0.145~0.373。结果显示四引物扩增受阻突变体系技术聚合酶链式反应是一种简单快速而有效SNP基因分型的方法。

利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术检测水稻光温敏核不育基因p/tms12-1

根据p/tms12-1基因存在的单核苷酸变异,利用四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra-primer ARMS-PCR)的方法设计特异引物,对11个两系不育系水稻品种(或品系)以及2个常规稻品系进行扩增。根据其PCR产物带型,可以准确鉴定光温敏核不育基因p/tms12-1的基因型,其检测结果与通过CAPS标记检测的结果完全一致。该方法成本低、简单、可靠,可用于p/tms12-1基因的鉴定和分子标记辅助育种。

多重嵌合引物对四引物扩增受阻突变体系PCR的改进及在卵巢癌相关位点中的应用

目的:建立一种简单快速的方法,可同时检测两个卵巢癌相关单核苷酸多态性位点rs608995和rs749292。方法:采用多重嵌合引物策略改进四引物扩增受阻突变体系聚合酶链式反应(PCR),通过设计rs608995和rs749292的特异性嵌合引物,经单管一次PCR,琼脂糖电泳分析产物长度。结果:对46份全血样本,电泳结果均与测序一致,可准确分型。结论:经多重嵌合引物策略改进的四引物扩增受阻突变体系PCR可简便、快速、准确的获得2个位点的分型结果。

四引物扩增受阻突变体系快速检测Wilson病基因Arg778Leu突变

目的建立一种不需要限制性片段长度多态性或直接测序的新方法检测肝豆状核变性(WD)病人突变热点ATP7B基因的Arg778Leu突变基因型。方法用四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(tetra-primer amplification refractory mutation system-PCR,tetra-primer ARMS-PCR)检测47例WD患者和30例正常对照的ATP7B基因Arg778Leu突变,并用测序进行验证。结果47例WD患者中检出Arg778Leu纯合突变4例,杂合突变14例,总检出率38.3%(18/47);30例正常对照未发现突变;DNA测序结果与四引物ARMS-PCR结果完全一致。结论ATP7B基因Arg778Leu突变是中国人WD突变热点;四引物ARMS-PCR法检测Arg778Leu突变有快速、简便、准确的优点,可以区分等位基因是否纯合,适于大样本的人群筛查。此法也可用于检测其他点突变。

四引物扩增受阻突变体系PCR在绵羊线粒体基因组SNP检测中的应用

为建立绵羊线粒体基因组SNP的四引物扩增受阻突变体系(tetra-primer amplification refractory mutation system,Tetra-primer ARMS)PCR检测方法,选择小尾寒羊线粒体T1112C和C11606T2个SNP,在等位基因特异PCR基础上,根据错配原理设计4条引物,优化PCR反应体系,采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果表明:T1112C位点检测中,所有个体均能扩增出569 bp最长片段的外引物产物(阳性对照),扩增出349 bp片段的个体为野生型,扩增出263 bp片段的个体为突变型。C11606T位点检测中,所有个体均能扩增出572 bp最长片段的外引物产物(阳性对照),扩增出408 bp片段的个体为野生型,扩增出213 bp片段的个体为突变型。在每个线粒体多态位点均检测到野生型和突变型2种基因型,没有发现异质性。应用Tetra-primer ARMS PCR方法,经一次PCR即可判定线粒体SNP位点的基因型,该方法快速、简便,可应用于绵羊线粒体SNP分型。

一种SNP检测新方法:四引物扩增受阻突变体系PCR技术

详细介绍四引物扩增受阻突变体系PCR技术的原理和分析方法 ,并简单介绍其在检测单核苷酸多态性中的应用 ,为该技术在医学和分子生物学等领域中的推广应用提供理论基础。

四引物扩增受阻突变体系分析少精、无精症患者白细胞MLH3基因C2531T突变

目的分析错配修复蛋白MLH3基因C2531T突变与少精、无精症的关系。方法以MLH3C2531T为例建立四引物扩增受阻突变体系(4P-ARMS-PCR)方法;分别用4P-ARMS-PCR和PCR-RFLP检测81例少精、无精症患者和80例正常对照者MLH3C2531T;随机抽取20%标本测序进行验证。结果MLH3C2531T的CT+TT基因型在患者中有明显的流行,且MLH3C2531T的T等位基因与疾病存在相关性(P<0.01);PCR-RFLP检测结果与4P-ARMS-PCR检测结果完全一致,测序结果相同。结论4P-ARMS-PCR可快速、简便、准确检测基因单核苷酸突变(SNP);错配修复蛋白MLH3C2531T多态性与少精、无精症存在相关性。

四引物扩增受阻突变体系PCR技术及其在动植物遗传育种研究中的应用

四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra-primer amplification refractory mutation system PCR,Tetra-primer ARMS PCR)技术是一种在普通PCR基础上发展起来的单核苷酸多态性(SNP)分型技术。该项技术综合了扩增受阻突变体系(Amplification refractory mutation system,ARMS)和四引物PCR(tetra-primer PCR)技术的优点,是对等位基因特异性PCR法的改良。它具有操作简便、分型快速、费用低廉等特点,在国内外生命科学领域尤其是遗传育种领域的应用越来越广泛。本文介绍了四引物扩增受阻突变体系PCR的技术原理及优势、结果检测手段和反应体系改进方法,并在此基础上对该技术在遗传育种研究中的应用进行综述。

四引物扩增受阻突变体系PCR在苦瓜抗白粉病分子标记开发中的应用

以苦瓜高抗、高感白粉病的父母本及其F2代为试材,根据双本测序比对获得的SNP突变位点来设计四引物ARMS PCR分子标记引物。采用正交设计L16(44)方法对模板DNA、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶4个因素和内外引物的浓度比进行体系优化,并利用优化后的体系对引物进行筛选。研究了适用于苦瓜的四引物ARMS PCR分子标记开发及引物筛选体系,以期为苦瓜抗白粉病分子标记辅助选择提供参考依据。结果表明:对优化后的四引物ARMS PCR体系验证,能正确地在父母本及其F2代中分型,优化后的体系适用于苦瓜抗白粉病的四引物ARMS PCR分子标记的筛选。

四引物扩增受阻突变体系PCR及其在水稻遗传育种研究中的应用

介绍了四引物扩增受阻突变体系PCR技术,阐述了该SNP基因分型技术的引物设计和反应体系优化方法,综述了该技术在水稻遗传育种研究中的应用,旨在推广这一简单、高效SNP基因分型技术。

13个快速突变Y-STR复合扩增体系的建立

目的 建立一套包含迄今所知全部13个快速突变Y-STR基因座的复合扩增检测体系,并对其进行性能验证及法医学应用价值评估。方法 采用五色荧光标记技术,通过引物设计、体系调配,构建出包含13个快速突变Y-STR基因座(DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS526、DYS449、DYS518、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626、DYS627)的一套复合扩增体系。根据文献和Sanger法测序,总结了一套快速突变Y-STR基因座的推荐命名方式。对该体系的灵敏度、种属特异性、抗抑制能力等性能及对DNA混合样本的扩增效果进行测试。结果 成功构建了一套快速突变Y-STR检测体系,归纳整理了一套推荐命名方式。经优化,该体系在退火温度为59℃、扩增循环数为28次时扩增效果最佳。体系灵敏度达0.125ng,有良好的种属特异性,对EDTA、血红素、腐殖酸及靛蓝等有较强的抗抑制能力。在高浓度的女性背景下(男女成分比为1∶4000),体系仍能扩增出完整的男性DNA分型。同时,对不同比例的男性DNA混合样本也表现出较好的扩增效果。结论 本文构建的复合扩增检测体系性能良好,可用于男性家系的精细化排查,可作为常见Y-STR检测试剂盒的重要补充。

四引物扩增受阻突变体系PCR检测水稻香味基因badh2方法的优化

badh2是控制水稻香味的主效基因,其与等位非香基因Badh2功能差异主要在于第七外显子上的8 bp缺失及3个SNP,开发其易于分辨且稳定的功能标记将有助于香稻分子育种。本研究基于四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra Primer Amplification Refractory Mutation System PCR,Tetra-primer ARMS PCR)原理,在功能差异位点外侧两引物一致的情况下,分别设计与badh2和Badh2完全匹配的5'端添加错配碱基的靶引物。结果表明,经1%的琼脂糖凝胶电泳后,由完全匹配引物组成的PCR体系基本能分辨badh2/Badh2基因型,但目标条带较模糊;而引物中5'端引入错配碱基的PCR体系能产生更明晰、易于分辨的目标条带。本研究将有助于香稻分子育种及为其他类似分子标记的优化提供借鉴。

用扩增受阻突变系统(ARMS)方法对PAM突变基因的快速检测

应用ARMS方法对一PKU家系成员进行了PAH突变基因的快速检测,结果鉴定:患儿为intron4切拼授端与R413P点突变的复合杂合子,其父母公别为上述突变基因的携带者。由于ARMS分析能用绒毛活检材料进行,所以,此法可用于遗传病的早期产前诊断。

PARMS在水稻基因编辑后代基因分型中的应用研究

基因编辑技术为植物基因功能研究和作物遗传改良提供了有效途径。目前基因编辑植株基因分型多采用PCR/RE法、PAGE检测法、Sanger测序法等手段,但这些方法存在操作复杂、耗时长或成本高等问题。PARMS技术(penta-primer amplification refractory mutation system,五引物扩增受阻突变体系)是最新开发出的基于荧光检测的SNP基因分型方法,具有操作简便、耗时短、成本低的优势。本研究利用PARMS技术对水稻CRISPR/Cas9基因编辑植株进行了基因分型,鉴定结果与PAGE检测和Sanger测序法一致,证明PARMS技术可用于水稻基因编辑植株后代基因分型,也为其它作物基因编辑后代基因分型技术选择提供了参考。

Tetra-primer ARMS PCR检测丙型肝炎患者IL-28B rs12979860基因多态性

目的评价四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(Tetra-primer ARMS PCR)检测IL-28Brs12979860基因多态性在丙型肝炎患者抗病毒治疗中的应用。方法选取2015年5月至2016年7月就诊的慢性丙型肝炎患者275例,提取外周血DNA,建立Tetra-primer ARMS PCR检测体系,与Sanger测序法对比验证,检测该地区丙型肝炎患者IL-28Brs12979860基因多态性分布情况。结果 Tetra-primer ARMS PCR检测体系成功建立,与Sanger测序法的符合率100%,rs12979860基因的C/C型、C/T型和T/T型的分布频率分别为86.5%、12.0%、1.5%。在C/C型组与C/T或T/T型组中,年龄分布、性别分布、HCV基因1b型比例差异均无统计学意义(P>0.05);患者肝硬化比例和持续病毒学应答比例比较差异有统计学意义(P<0.05),在C/T或T/T组中肝硬化比例较高,在C/C组中持续病毒学应答比例较高。结论该研究建立的Tetra-primer ARMS PCR技术是一种操作简单、成本低廉、快速有效的基因多态性检测方法,对于丙型肝炎患者IL-28Brs12979860基因多态性基因分型具有很好的临床应用价值。

小麦抗麦红吸浆虫候选基因TraesCS4A01G437800的四引物ARMS-PCR标记开发

麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana Géhin)是影响我国小麦生产的重要害虫,选育抗虫小麦品种是控制虫害最为有效的措施,而利用通量高、成本低的抗虫相关标记对提高小麦抗虫种质资源筛选和分子育种效率具有重要意义。本研究根据前期挖掘到的抗虫候选基因TraesCS4A01G437800序列中存在的SNP位点开发了1个四引物ARMS-PCR标记T3-1-1,并在92个RIL株系和95个小麦品种中进行了标记有效性检测。结果表明:T3-1-1在RIL株系间的检测有效率在90%左右,在供试高抗、高感小麦品种中的检测有效率较高,分别为63.16%和96.43%,可用于小麦种质资源的抗虫性筛选和抗虫性分子标记辅助选择。进一步分析发现,在具有抗虫位点的14个抗虫小麦品种中,多为生产上很少使用的老品种,因此鉴定和创新小麦抗虫种质资源尤为重要。

T-ARMS PCR多重检测方法研究

目的 建立有错配的加尾双引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(T-ARMS PCR)多重检测的方法,实现针对肝细胞癌常见基因突变位点TP53 R249S、TP53 R273H、CTNNB1 S45F的多重检测。方法 针对3个基因突变位点进行引物设计,每个基因突变位点所设计引物序列的5′端不加一段DNA序列(Tail Free Primer)或者所设计的引物序列5′端加一段相同的DNA序列(Tailed Primer),利用实时荧光定量PCR仪分别检测并比较3个基因突变位点的不同引物序列形成的单重体系、三重体系的扩增结果,研究T-AMRS PCR方法对突变型基因位点突变负荷的检测限、特异性和多靶标检测能力。结果 3个基因突变位点Tailed Primer单重体系扩增结果显示,突变型质粒的扩增均优于野生型质粒,野生型质粒的扩增均被有效抑制,突变负荷检测限低至0.10%,特异性良好。Tailed Primer三重体系减少了引物二聚体的产生,调控CTNNB1 S45F、TP53 R249S、TP53 R273H的解链温度分别为81.11℃、82.36℃、86.35℃,实现不同突变位点的显著区分。与Taqman探针基因分型方法相比,T-AMRS PCR方法野生型和突变型基因的Ct值差异更显著,单荧光通道即可实现突变基因检测。结论 运用T-ARMS PCR进行一管三重检测,分析熔解曲线,能有效检测到目的基因突变,抑制野生型模板的扩增,并区分不同的基因突变位点;同时,Tailed Primer设计减少了多重情况下引物二聚体的产生。该方法可为临床中肝细胞癌的早期筛查、预后预测、病情监测提供理论依据。

基于四引物扩增受阻突变体系PCR的多重乳腺癌相关SNP位点检测方法的建立

为提高单核苷酸多态性检测的通量,引入多重嵌合引物PCR和毛细管电泳对四引物扩增受阻突变体系PCR进行改进.针对乳腺癌位点rs4784227(C>T),rs1219648(G>A)和rs3803662(T>C)设计特异性嵌合引物,经一次PCR扩增后,通过毛细管电泳分析产物长度,同时确定3个位点的基因型.70份全血和口腔拭子样本,电泳结果均与测序一致,实现成功分型.本方法仅需一次PCR和一次毛细管电泳即可获得3个位点的分型结果,操作简单、快速准确.