新冠核酸检测异常扩增曲线及应对措施

探讨新冠核酸检测异常扩增曲线出现的原因,并提出相应的解决措施。荔浦市人民于2020年7月开始新冠核酸检测工作,检测过程中发现了常见的10种新冠核酸检测异常扩增曲线。本文对这10种新冠核酸检测异常扩增曲线的发生原因进行分析,并提出应对措施。

血液核酸筛查非特异扩增曲线的原因分析

目的 分析血液筛查Roche Cobas s201核酸检测系统非特异扩增曲线产生的原因。方法 统计本室2014年10月-2015年12月用Cobas Taq Screen MPX v2.0核酸试剂检测产生非特异扩增曲线的次数,探讨其发生与时间、检测系统（A、B和C系统）和试剂批号（批号1、批号2、批号3、批号4、批号5和批号6）之间的关系。结果 本室核酸检测非特异扩增曲线总发生率为0.386%（86/2 228）;不同月份（χ2=27.325,P〈0.05）、不同检测系统（χ2=66.305,P〈0.05）和不同批号试剂（χ2=129.550,P〈0.05）之间的非特异扩增曲线发生率均有差异,其中2015年2月份、C检测系统和试剂批号2的发生率在各分项中均最大,分别为0.893%（10/1 120）、3.17%（10/315）和5.26%（10/190）;非特异扩增曲线类型中以HCV曲线出现47次最多,占54.65%（47/86）。结论 核酸检测非特异扩增曲线的发生与检测系统和试剂批号有明显相关性,加强对检测系统的管理和试剂确认管理能够提高核酸检测性能。

扩增曲线在分析PCR核酸检测无效原因及其过程改进中的作用

目的通过扩增曲线图形分析,判断PCR核酸检测无效结果的发生原因,以便及时采取纠正预防措施,降低无效检测率,提升核酸检测效率和质量。方法提取本实验室2017年11月—2018年6月期间Roche Cobas s201检测系统所有无效扩增的曲线。结合扩增曲线形态,综合环境、仪器归类并分析找出引起无效扩增的原因。依据Pareto图分析原则对引起无效扩增的主要因素采取相应干预措施,分析各类无效扩增在不同月份间产生无效扩增率,以评估采取相应干预措施是否有效。结果 1)无效扩增曲线归类:本实验室2017年11月—2018年6月PCR核酸检测无效扩增数为53个(0. 21%,53/25 752),按曲线的特征可将53个无效扩增曲线归为7类。Pareto图分析显示:锯齿状扩增曲线(64. 15%,34/53)、单独内参通道未扩增曲线(13. 21%,7/53)和靶标通道未扩增曲线(9. 43%,5/53)的累积百分数为86.70%,是引起无效扩增主要因素(A因素);HCV通道的异常扩增曲线(7. 55%,4/53)定义为B因素;四通道成'V'形状扩增曲线(1. 89%,1/53)、四通道扩增曲线整体抖动(1. 89%,1/53)、某通道起跳过早致Ct值较小扩增曲线(1. 89%,1/53)占比较小,定义为C因素。2)无效扩增曲线发生分布:A因素的锯齿状扩增曲线在2017年11月—2018年6月期间每个月均有不同程度发生,单独内参通道未扩增曲线主要集中在2017年12月、2018年3、5月;其它类型无效扩增曲线主要分布在2017年12月和2018年3月份。3)干预措施的效果:2017年12月中旬开始逐渐对A因素可人为干预的原因(如环境、设备)采取环境、设备维护等相应干预措施,总无效扩增率由2017年11月份0. 47%降低至2018年6月0. 03%。不同月份之间无效扩增率差异显著(χ~2=27. 02,P<0. 05);实施干预措施后,A因素锯齿状扩增率各月变化最为显著(χ~2=21. 91,P<0. 05),由干预前2017年11月份0. 37%逐月降低到2018年6月0. 03%。结论产生无效扩增的原因是多方位的。实验室可根据无效扩增曲线图形结合检测通道Ct值变化特点趋势,综合环境、仪器状态定位无效扩增原因。针对可以人为干预的因素,如环境因素、设备维护因素造成的无效扩增,制定相应干预措施以降低无效率;针对试剂性能变化产生的无效扩增,应制定质量监控措施以及时发现问题。

血液核酸筛查PCR异常扩增曲线的分析与处理

目的分析血液核酸筛查PCR异常扩增曲线产生的原因,并采取相应的处理措施。方法统计分析本实验室2018年1—6月异常扩增曲线出现的频率和类型。结果本实验室核酸扩增检测无效率为0. 83%(71/8 522),由扩增曲线异常引起的结果无效率为0. 18%(16/8 522),约占检测无效率的22. 5%。其中扩增曲线受到抑制占比为75%,扩增曲线形状异常占比为25%。结论结合数据软件并人工复查核酸扩增曲线,对异常扩增曲线加以分析和处理,从而确保核酸检测结果的有效性和准确性。

新型冠状病毒检测中几种扩增曲线的探讨

目的对于新型冠状病毒核酸检测中发现的几种非特异性扩增曲线进行探讨,以供后续实验参考。方法参照《新型冠状病毒感染的肺炎防控方案(第六版)》附件3《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》中的方法,对鞍山市疾控中心某月收检的标本进行新型冠状病毒核酸检测,回溯实验结果,发现存在的问题。结果 5月份共检验5 090份样本,结果均为阴性;试剂A、B的检测结果中出现了一定数量的N基因特异性扩增曲线及非特异性扩增曲线(特异性接近S形Ct值<38的扩增曲线,非特异性为非S形Ct值<38的扩增曲线),C、D试剂盒未发现相似问题;试剂A、B两种试剂盒检测结果中出现了少量的ORF1ab基因特异性扩增曲线及非特异性扩增曲线,曲线形状有平行线形、斜线形、翘尾形和不规则的形态,均使用了另外一种试剂盒复检,均为阴性;部分检测结果呈现出阳性对照扩增曲线不圆滑不标准呈现锯齿状的情况。结论无明显的S形扩增曲线且未检出Ct值,检测过程中出现N基因或ORF1ab非特异性扩增曲线及阳性对照扩增曲线异常呈锯齿状。

凝胶成像系统对核酸扩增产物的定量检测

目的 建立一种PCR-凝胶成像系统定量分析核酸扩增产物的方法．方法：1．用PCR荧光定量分析仪实时监测PCR扩增曲线，并选择合适的扩增循环次数，2．将梯度标准血清(10^1～10^6拷贝／u1)分别进行40，35及32次循环次数的扩增，在琼脂糖电泳，EB染色后，进行凝胶分析；3．选择凝胶分析软件中能客观反映核酸实际含量的最适参数，制定标准曲线。结果:40及35次循环时，在10^1～10^4拷贝／ul，线性良好，而在10^4，10^5及10^6拷贝／ul三个梯度时直线上升缓慢，趋于平坦；32次循环时，10拷贝／ul未能检出，10^2～10^6拷贝／ul的5个梯度的模板(对数值)与产物(体积)有良好的线性关系(r=0．97)。结论：32次循环线性范围较广，为最适循环次数；在UVIband的光密度定量分析指标中，以体积或体积百分比作为定量指标较好；本法除可用于常规PCR产物定量(HBV-DNA，TB—DNA)，也适用于RT-PCR(HCV-RNA)。

双标准曲线相对定量PCR试验原理与方法

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是一种准确有效的核酸定量分析技术,具有易操作、高通量、高敏感性、高特异性、高度自动化和低污染等优点,并随新定量PCR仪及新操作方法的发展而得到广泛应用,但是,定量PCR的高敏感性特点使得实验操作严格而繁琐。阐述了一种改进的相对定量方法——双标准曲线法的试验原理和特点,描述了定量PCR体系的优化方式,探讨了试验误差分析方法及试验操作技巧,并就试验数据的处理方法进行讨论。试验证明,双标准曲线法是一种经济、简单而准确的定量方法。

荧光定量聚合酶链反应异常曲线产生原因及处理

荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术是1993年美国Ap-plied Biosystems公司推出,通过比较样本的循环数或称为循环阈值（Ct）与已知起始靶分子数的标准系列（如校准曲线）,来得到未知样本的起始靶数量。荧光定量PCR技术对肿瘤学、遗传学、免疫学、微生物学、寄生虫学和基因治疗等进一步研究及临床应用起积极重要的作用。

便携式实时荧光定量PCR仪数据处理方法研究

实时荧光定量PCR越来越多被用来定量核酸的表达水平,随着经济与社会的发展进步,个人的自我保护意识和自身健康都重视了起来,使得人们对健康有了更高的要求,适应于现场核酸分析技术的需求日渐显著,不同的仪器有不同稳健的、合适的测量分析方法。本研究针对一种基于转盘式荧光检测的便携式实时荧光定量PCR仪的数据进行处理分析,通过对比优化不同峰值拟合算法及扩增曲线拟合算法优化提升了光学系统检测性能。结果表明,针对该系统峰值拟合算法采用正弦拟合对原始数据进行处理有较好的效果,扩增曲线拟合算法采用4参数logistic拟合,标准品浓度梯度样本扩增结果线性拟合优度R^(2)>0.990,变异系数CV值小于5%,使得光学系统检测性能有所提升,为该类检测模型仪器的数据处理方法提供了一定参考。

实时荧光定量PCR技术的操作实践

采用Mx3000P型实时荧光定量PCR仪,以SYBRGreen I法相对定量技术为例,设计1例检测针对HIV-1 vpr基因的特异性siRNA基因沉默效果的实验。介绍了实时荧光定量PCR技术上机前样本的制备过程、检测程序及相关参数的设置方法等操作流程;结合熔解曲线、扩增曲线进行结果分析;强调了实验整体设计、引物设计与PCR反应体系的优化和内参的恰当选择在实时荧光定量PCR技术中的重要性。

水稻低丰度表达基因OsAMT1;3实时荧光定量PCR方法的建立及其应用

采用实时荧光定量PCR技术，通过使用特异引物，对水稻中的低丰度表达基因OsAMT1；3进行了转录水平上的定量分析，成功建立了可检测低丰度表达基因的SYBR Green实时荧光定量PCR技术平台。该方法具有很好的准确性和实用性。获得的荧光定量PCR扩增曲线，基线平整，指数区明显，斜率大且固定；线性范围广，17～36个循环都能测出；稳定性、重复性好，变异系数仅为0．47％；标准曲线表明，循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系，可对基因表达进行相对定量；缺氮条件下OsAMT1；3与纯NH4^＋处理相比表达量增加4倍以上。

LAMP研究中的常见问题分析及解决方法

本文通过《小反刍兽疫病毒RT-LAMP快速检测和鉴别方法的建立》研究中的相关扩增曲线和试验结论,对LAMP研究中出现的几种问题进行了初步探讨,并提出解决方案。文章从气溶胶污染、非特异性扩增、扩增效率不高和扩增曲线常见问题分析等方面,分析其产生原因并总结了相关解决办法,从而为今后的LAMP技术研究和推广做出贡献。

滇南中蜂蜂王卵黄原蛋白基因实时荧光定量PCR的建立

采用实时荧光定量PCR技术,以蜜蜂β-act in基因为内参,利用特异引物对滇南中蜂蜂王的卵黄原蛋白基因进行了转录水平上的定量分析。结果表明:所建立的SYBR Gr een-II实时荧光定量PCR技术扩增效率E=99.9%,R 2=0.99,最低检出量为13个循环。检测灵敏度高,能准确定量滇南中蜂初生蜂王中的Vg基因。

不同抗性番茄叶片接种晚疫病后总RNA提取方法及实时荧光定量PCR比较

为筛选出适合番茄晚疫病接种材料总RNA的提取方法,本研究选取番茄感病5#自交系和抗病CLN2037E自交系正常生长和晚疫病接种的叶片为材料,比较Takara公司（货号）9109、9752Q、9769S和北京华越洋公司ZH120等4种RNA提取试剂盒。结果表明：方法 9109和ZH120均能获得较清晰的RNA电泳条带。ZH120提取RNA的OD260nm/OD280nm在1.92-2.08之间,得率在316.38-359.71μg/g之间,其他3种方法提取RNA的完整性和纯度均不高。四种方法提取的RNA均能通过反转录PCR克隆出番茄Actin和RPL2基因片段。以ZH120方法提取的RNA为模板时,基因RPL2实时荧光定量PCR的溶解曲线峰值单一,扩增曲线和Ct值重复性好,变异系数低。结果表明：ZH120试剂盒可作为番茄正常及晚疫病接种叶片RNA提取的适宜方法,并为后续基因克隆及表达谱分析等分子生物学研究提供高质量的RNA。

荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的研究

目的用荧光定量PCR对HBV-DNA载量进行实验性研究。方法扩增含有3个乙肝病毒基因组pBR322质粒中的乙肝病毒目的序列,并通过AT亚克隆至pBS-T载体中。经过筛选、鉴定及测序验证保证相对更高的拷贝数。对3个保守序列进行了常规PCR退火温度的优化和灵敏度的检测,建立荧光定量PCR反应体系从而制备标准曲线。结果曲线相关系数为99.5%,具有较高的可信度。负相关范围在5×10^3-5×10^9copies/μl。不论是批内还是批间其变异系数值均小于5%。结论荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA可以灵敏度好,准确度高,应加大研究降低成本应用于检验应用。

单核苷酸多态性分析方法

SNP是第三代遗传标记,在法庭科学及其领域中具有重要作用。当前,已建立了许多SNP分析方法,本文介绍变性高压液相色谱法、时间飞行质谱熔解曲线法、熔解温度曲线法、等位基因特异扩增结合熔解曲线法、分子信号和TaqMan等新的SNP分析方法。

实时荧光定量PCR实验中常见的几个关键注意事项

近年,从科学研究到临床检测,从"非洲猪瘟"的检测到"新冠病毒"的检测,荧光定量PCR仪器已成为分子生物学研究的常规设备。检测方法的迅速发展,检测任务的紧急也对检测人员提出了更高的要求,需要他们具备熟练操作能力和分析判断数据结果的能力。对于荧光定量PCR结果,最直观的判断就是看CT值和扩增曲线是否正常。很多人在平时实验中会遇到异常扩增曲线的困扰,比如,核酸污染风险引起样本阳性、打折的扩增曲线、复孔间重复性不好和阴性样本扩增曲线抬升等。

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测中的常见问题

目前,各级兽医实验室主要采用荧光定量PCR开展ASFV检测工作。但在日常工作中,常常出现假阳性、阳性对照或阳性样品不显示Ct值和检测样品无典型"S"形扩增曲线但其Ct值显示为阳性等问题。笔者通过查阅大量文献以及结合平时的工作经验,分析了上述问题的可能原因和解决方案。

中华人民共和国农业农村部公告 第172号

为确保兽用生物制品质量安全,防止非洲猪瘟病毒污染相关制品,根据《中华人民共和国动物防疫法》《重大动物疫情应急条例》《兽药管理条例》等法律法规规定,自2019年5月25日起,各兽用生物制品生产企业(以下简称'生产企业')应对兽用生物制品生产过程中使用的毒种、原辅材料、半成品、成品等全面开展非洲猪瘟病毒核酸检测,并做好检测结果报送和后续处置工作。现就有关事项公告如下。