核酸扩增荧光检测技术(PCR)检测肺炎支原体(MP)在社区幼儿获得性肺炎辅助诊断中的意义

目的肺炎支原体(MP)核酸扩增荧光检测技术(PCR)测定在社区幼儿获得性肺炎早期辅助诊断的意义。方法收集玉林市二医院住院及社区幼儿门诊就诊患呼吸道感染及发热幼儿310例,通过三种不同方法即PCR法、血清法和培养法测定MP-DNA及MP-Ab,分析这三种方法测定结果的时间性、敏感性、特异性。评价PCR早期测定方法诊断的可行性。结果 PCR早期测定MP方法与血清法比较有统计学意义(P<0.5),与培养法比较无统计学意义(P>0.5)。结论核酸扩增荧光检测技术(PCR)可作为检测社区幼儿肺炎支原体(MP)早期检测诊断指标。

微量淋巴细胞毒技术与核酸扩增荧光技术检测HLA-B27的对比

目的通过比较核酸扩增荧光技术(PCR-染料法)和微量淋巴细胞毒技术在检测HLA-B27中的符合率,分析两种方法的优势与不足,探讨核酸扩增荧光技术(PCR-染料法)在HLA-B27检测中的临床应用价值。方法随机选取197例来我科就诊的疑似强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)患者的样本,分别使用微量淋巴细胞毒法和PCR-染料法检测。并对两种方法检测结果不符的样本进行测序复核。结果 197例样本中,微量淋巴细胞毒法检出HLA-B27阳性150例,阴性47例;PCR-染料法检出阳性135例,阴性62例;两种方法检测结果有统计学差异(P<0.01)。15例差异样本,两种方法与测序法相比较的符合率,微量淋巴细胞毒法为13.3%,PCR-染料法为86.7%。结论核酸扩增荧光技术(PCR-染料法)和微量淋巴细胞毒法比较,前者具有更高的临床准确性。在样本处理上PCR-染料法也更具优势,操作简单方便,有很强的临床应用价值。

肉类食品的动物物种基因鉴别及等温扩增荧光(IAFT)快速检测技术的建立

食品安全是国家公共安全的重要组成部分,直接影响人类健康、公共卫生和社会稳定。随着全球性食品安全事件的持续发生,食品安全问题日益严峻。因此,建立快速、有效、精确的肉类制品物种鉴定技术和快速检测方法已成为一项重大课题。基于此,根据分子生物学基因扩增技术发展趋势,集成核酸等温扩增核心技术,以等温扩增荧光快速检测技术为基础,收集不同的动物物种样品进行基因序列分析,确定靶基因序列,针对目的片段设计特异引物,组合新型DNA聚合酶,在特定温度条件下复制和扩增,并与传统PCR技术比较,筛选、优化、建立了灵敏度更高、扩增速度更快、特异性更强的肉类食品的动物物种基因鉴别SGI(Species gene identification)的等温扩增荧光(Isothermal Amplification Fluorescent Technology,IAFT)快速检测技术,并取得阶段性成果,为食品安全的质控和监管提供必要的技术支撑,作为肉类食品及其制品的现场快速物种特异鉴定的检测手段。

等温扩增荧光技术快速检测沙门氏菌的研究

本文研究并建立等温扩增荧光技术快速检测沙门氏菌的方法。通过对沙门氏菌的SSAQ基因序列保守区设计引物,采用最佳引物组搭配其他配套试剂建立一种针对沙门氏菌的等温扩增荧光技术快速检测方法;采用直扩法提取DNA,通过等温扩增荧光技术与常规PCR法对不同浓度沙门氏菌进行扩增检测,检测最低检测限,对其灵敏度进行评价。结果表明,所建立的针对沙门氏菌等温扩增荧光检测的方法与常规PCR法相比,等温扩增荧光检测的方法灵敏度更高,且根据干扰实验结果可知该方法对沙门氏菌具有良好的特异性,所建立的针对沙门氏菌的等温扩增荧光技术检测方法具有操作快捷、简便、反应时间较短、良好的特异性和较高的灵敏度的特点,能够用于沙门氏菌的快速检测。

等温扩增荧光法快速鉴定羊肉掺假

本文建立了快速鉴定羊肉掺假的等温扩增荧光检测方法。针对羊的线粒体Cytb基因设计两套引物,在恒温下,以直扩法处理的样本为模板进行扩增,通过特异性、灵敏度实验对该方法体系进行验证和分析。结果表明,最佳反应温度为65℃,最低检测限为5.54×10^(-5) ng·μL^(-1)。本研究建立的等温扩增荧光法快速鉴定羊肉掺假结果准确可靠、反应快速,具有良好的特异性和灵敏度,可以同时满足实验室和现场检测要求,为快速鉴定羊肉种属提供了一种新的检测方法,为其他肉类种属快速鉴定提供理论依据。

宫颈癌筛查应用多重核酸扩增荧光检测的意义评估

目的探讨宫颈癌筛查应用多重核酸扩增荧光检测的意义并进行评估。方法选取2017年9月-2018年3月期间在我院进行妇科检查的120例妇女纳入本研究,对其进行宫颈癌筛查。行多重核酸扩增荧光检测及第二代杂交捕获试验检测。结果120例妇女行多重核酸扩增荧光检测出27例高危型HPV。第二代杂交捕获试验检测出30例高危型HPV,两者具有高度一致性。结论宫颈癌筛查过程中采取多重核酸扩增荧光检测方法,检出率与常规方案具有较强一致性,应在临床中广泛使用。

结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测对菌阴空洞肺结核的诊断效能分析

目的探讨结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(Xpert)检测对菌阴空洞肺结核的诊断效能。方法选取河北省胸科医院2021年4月至2022年10月期间行手术治疗的124例肺部空洞疾病患者相关病历资料,其中菌阴空洞肺结核86例(观察组),非结核肺部空洞疾病38例(对照组)。收集患者手术标本Xpert检测和外周血结核感染T细胞斑点(T-SPOT)试验结果,分析二者对菌阴空洞肺结核的诊断效能。结果Xpert检测和T-SPOT试验诊断菌阴空洞肺结核的敏感度为68.6%、75.6%,特异度为97.4%、68.4%。Xpert检测的敏感度低于T-SPOT试验(χ^(2)=5.832,P<0.001),特异度高于T-SPOT试验(χ^(2)=21.469,P<0.001)。2种方法在观察组中的阳性检出率均高于对照组[Xpert检测:68.6%(59/86)比2.6%(1/38);T-SPOT试验:75.6%(65/86)比31.6%(12/38)](均P<0.001)。受试者工作特征曲线分析结果显示,Xpert检测诊断菌阴空洞肺结核的曲线下面积为0.830,T-SPOT试验的曲线下面积为0.729,Xpert检测的准确度高于T-SPOT试验(P<0.001)。结论Xpert检测对菌阴空洞肺结核有比较可靠的诊断效能。

RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术在儿童支原体肺炎早期诊断及疗效判断中的价值

目的 考察实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)在儿童肺炎支原体肺炎(MPP)早期临床诊断中的价值及其在评价MPP转归以及判断药物疗效中的作用。方法 选取社区获得性肺炎(CAP)住院患儿451例,所有患儿在入院24 h内采集血清标本,采用被动凝集试验检测肺炎支原体(MP)特异性抗体[MP抗体检测(MP-Ab)],并采集咽拭子标本提取MP-RNA(MP-SAT法)。对MPP患儿在完成大环内酯类药物治疗第1疗程、完成大环内酯类药物治疗第3疗程时复查MP-Ab和MP-RNA。根据MPP诊断标准将其分为MPP组(n=183)和非MPP组(n=268)。比较MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性(敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值)。对病程<7 d入院前未使用大环内酯类药物的MPP患儿进行动态观察,考察在大环内酯类药物(阿奇霉素)治疗MP不同时间点(入院时、完成第1疗程和完成第3疗程时)MP-SAT和MP-Ab的阳性率以及患儿临床和影像学表现(咳嗽、发热、肺部体征和CT表现)变化情况。结果 MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性比较差异无统计学意义(P>0.05);病程<7 d患儿组中MP-SAT诊断MPP的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均优于MP-Ab(P<0.001或P<0.05或P<0.01)。病程<7 d入院前未使用大环内酯类药物治疗的MPP患儿共42例,该组患儿在入院时、完成阿奇霉素治疗第1疗程和完成阿奇霉素治疗第3疗程时,MP-SAT检测阳性率分别为88.09%(37/42)、88.09%(37/42)和9.52%(4/42);MP-Ab检测阳性率分别为26.19%(11/42)、100.00%(42/42)和100.00%(42/42),在不同时间点MP-SAT和MP-Ab阳性率比较差异有统计学意义(P<0.001,P<0.05,P<0.001)。该组患儿完成第3疗程时MP-SAT阳性率较入院时明显下降(P<0.001),临床症状(咳嗽、发热)、肺部体征及肺部CT表现较入院时明显好转(均P<0.001),MP-SAT结果与临床症状、肺部体征及肺部影像学表现变化趋势相一致。结论 SAT检测MP-RNA可作为儿童MPP的早期诊断依据,同时也可作为评价MPP转归及判断临床治疗效果的指标。

猪伪狂犬病毒荧光重组酶介导核酸扩增快速检测方法的建立与应用

【目的】基于荧光重组酶介导核酸扩增(Recombinase-aided amplification,RAA)技术,建立一种猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)快速检测方法。【方法】根据PRV gE基因序列,设计特异性引物及探针,优化扩增体系,建立PRV荧光重组酶介导核酸扩增检测方法,检验其特异性、敏感性和重复性,应用该方法对临床样品进行检测。【结果】该方法在43℃恒温反应23 min即可完成PRV核酸扩增,最低检出限为111 copies·μL^(-1);与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrheavirus,PEDV)、猪轮状病毒(Porcinerotavirus,PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)均无交叉反应。重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于5%;40份临床样品检测结果显示PRV阳性率为15%(6/40),检测结果与常规聚合酶链式反应(PCR)一致。【结论】成功建立了简便快速、高效准确的PRV实时荧光RAA检测方法,为PRV的快速检测和流行病学调查提供了新的检测手段。

实时荧光环介导等温扩增快速分型致泻大肠埃希氏菌方法的建立

致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenic Escherichia coli,DEC)是一种重要的食源性致病菌,该研究立足DEC目前流行率高、基层分型困难的现状,建立了快速分型5种DEC的实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。针对DEC的8段特征性毒力基因pic、aggR、lt、st、stx 1、stx2、escV、invE及大肠埃希氏菌属特异性基因uidA设计LAMP引物,优化反应体系,并对方法的分析性能及临床菌株分型效果进行了评价。结果显示,所建立的方法对pic和escV的检出限是1 ng/μL,对aggR、stx 1、invE和uidA的检出限是100 pg/μL,对lt、st和stx 2的检出限是10 pg/μL,该方法灵敏度与特异度均为100%,DEC型别间无交叉反应,对临床菌株的分型与实际结果完全一致。方法快速简便、设备要求低,借助恒温荧光读取设备可在40 min内迅速判定待检菌株是否为DEC及其致病类型,可满足各机构现场快速检测的需求。

多重核酸扩增荧光检测技术在宫颈癌筛查中的效果评价

[目的]评价高危型人乳头瘤病毒(HPV)多重核酸扩增(Multiplex PCR)荧光检测技术在宫颈癌筛查中的作用。[方法]2007年10月至2008年6月,对深圳市30～59岁两社区人群(上梅林社区、紫薇社区)和两医院人群(北京大学深圳医院、深圳市妇幼保健院)中合格妇女进行宫颈癌筛查。对每位妇女同时取3份宫颈脱落细胞标本,分别用于第二代杂交捕获试验(HC-Ⅱ)、高危型HPV Multiplex PCR荧光检测和细胞学检查。对两种HPV检测方法任一阳性或细胞学结果异常的妇女行阴道镜下直接活检。以病理诊断为金标准,评价Multiplex PCR荧光检测筛查宫颈癌及宫颈鳞状上皮内高度病变(CINⅡ/Ⅲ)的准确性,并与HC-Ⅱ结果进行一致性比较。[结果]在1988例有效样本中,CINⅡ/Ⅲ和宫颈癌占4.0%。Multiplex PCR荧光检测和HC-Ⅱ的HPV阳性率分别为19.8%和17.8%。Multiplex PCR荧光检测的灵敏度、特异度、Yonden指数、阳性预测值和阴性预测值分别为92.3%、83.1%、75.4%、18.3%和99.6%,HC-Ⅱ的以上各指标分别为97.4%、85.5%、82.9%、21.5%和99.9%。两种方法的一致率为87.8%,Kappa值为0.60。两种检测方法测定的HPV病毒载量均随病变程度加重而增加(P<0.0001)。[结论]高危型HPV Multiplex PCR荧光检测技术的灵敏度和特异度高,与HC-Ⅱ相比两者具有较好的一致性,有较好的临床应用价值。

荧光定量核酸扩增检测技术与环介导等温扩增技术在呼吸道感染病原体检测中的对比研究

目的对比荧光定量核酸扩增检测技术与环介导等温扩增技术在呼吸道感染病原体检测中的应用价值。方法随机在2020年1月~2023年1月天津市河东区疾病预防控制中心接收的呼吸道感染的患者中选取120例作为研究对象,分别采用荧光定量核酸扩增(PCR)检测技术与环介导等温扩增技术(LAMP)检测呼吸道病原体,并对检测结果进行比较分析。结果120例患者中使用LAMP检出细菌感染85例(阳性率为70.83%)。荧光定量PCR检出细菌感染72例(阳性率60.00%),差异无统计学意义(P>0.05);其中LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的检出率高于荧光定量PCR法,差异有统计学意义(P<0.05);采用荧光定量PCR与LAMP法对呼吸道感染10种病原体进行检测,结果表明,除LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、流感嗜血杆菌的检测一致性极好,荧光定量PCR对耐甲氧西林葡萄球菌的检测一致性极好(Kappa≥0.75),其余病原体采用荧光定量PCR与LAMP法检测一致性均中等(0.4≤Kappa<0.75)。结论荧光定量PCR与LAMP两种检测方法对呼吸道感染病原体检出率均较高,其中LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的检出率高于荧光定量PCR法。

利用双重实时荧光重组酶辅助扩增技术快速检测肉制品中鼠源性成分

为实现肉制品中大鼠和小鼠源性成分的同步检测,基于实时荧光重组酶辅助扩增(real-time recombinase-aided amplification,Rt-RAA)技术,以大鼠COX3基因和小鼠16S rRNA基因序列保守区域为靶标,分别设计相应的Rt-RAA引物和探针,通过反应参数的优化确定最佳双重Rt-RAA检测反应条件。进一步对建立的双重Rt-RAA检测方法进行特异性、灵敏度及稳定性评估,并应用该方法对模拟市售肉制品进行检测。结果表明,所建立的双重RtRAA检测方法特异性强、稳定性好,大鼠和小鼠源性成分的检出限分别为0.5%和0.2%,同步检测2种源性成分检出限为0.5%,同步检测混合模拟市售样品检出限仍低至0.5%,双重Rt-RAA与实时荧光定量聚合酶链式反应对市售样品和模拟样品检测结果高度一致。因此,本研究建立的双重Rt-RAA检测方法适用于大鼠和小鼠源性成分的检测,为肉制品掺假检测提供了一种快捷、高效及准确的新方法。

基于实时荧光重组酶聚合酶扩增技术的铜绿假单胞菌快速检测方法的建立

目的 针对铜绿假单胞菌毒力基因exoS,建立一种实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)技术检测方法,并评价该方法的特异性、灵敏度及实用性。方法 根据铜绿假单胞菌毒力基因exoS的特异性保守区域,设计RPA特异性引物和探针,对提取的目标DNA进行检测,确定RPA方法的特异性和灵敏度;建立实时荧光定量PCR(qPCR)法,对目标DNA进行检测,比对不同检测方法对铜绿假单胞菌的检出限;通过临床样本性能验证试验,进一步确定RPA技术检测铜绿假单胞菌的可行性。结果 建立的RPA检测方法特异性良好,仅对铜绿假单胞菌有特异扩增曲线,对其他细菌无特异扩增曲线;RPA方法检测病原菌的灵敏度为5×10^(2) cfu/mL,该方法与qPCR法检出限一致且结果可靠;RPA方法检测时间仅需30 min,明显短于传统方法的检测时间。结论 该研究建立的铜绿假单胞菌RPA检测方法特异性强、灵敏度高,相对于传统检测方法明显缩短检测时间,可用于临床标本中铜绿假单胞菌的快速检测。

抗酸涂片与利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测在耐药肺结核诊断中的应用价值

目的探讨抗酸涂片与利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(Xpert MTB/RIF)检测在耐药肺结核(PTB)诊断中的应用价值。方法选取2020年3月至2022年3月福建省漳州市龙海区疾病预防控制中心收治的95例疑似耐药PTB患者作为研究对象。采集患者的纤维支气管镜肺泡灌洗液进行病原菌分离鉴定(阳性标本进行药敏试验)及抗酸涂片与Xpert MTB/RIF检测。比较病原菌分离鉴定和药敏试验、抗酸涂片及Xpert MTB/RIF检测的阳性率,并以病原菌分离鉴定和药敏试验结果为金标准,比较抗酸涂片、Xpert MTB/RIF检测对耐药PTB的诊断价值及与金标准的一致性。结果95例疑似耐药PTB患者病原菌分离鉴定和药敏试验阳性率为36.84%(35/95),抗酸涂片阳性率为29.47%(28/95),Xpert MTB/RIF检测阳性率为42.11%(40/95),差异有统计学意义(P<0.05)。以病原菌分离鉴定和药敏试验结果为金标准,Xpert MTB/RIF检测的诊断灵敏度、特异度、准确度均高于抗酸涂片,且与金标准的一致性高于抗酸涂片,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论抗酸涂片与Xpert MTB/RIF检测均对耐药PTB具有良好的诊断价值,但Xpert MTB/RIF检测的价值优于抗酸涂片。

宫颈癌筛查应用多重核酸扩增荧光检测技术的效果观察

目的分析探讨高危型人乳头瘤病毒（HPV）多重核酸扩增荧光检测技术在宫颈癌筛查中的应用效果。方法将2013年2月至2014年4月期间本院中28～58岁的合格妇女210例纳入研究对象，对其进行宫颈癌筛查。结果本次研究中的210例妇女，宫颈癌及宫颈鳞状上皮内高度病变占总数的9．53％；多重核酸扩增荧光检测和第二代杂交捕获试验的准确性和有效性趋向一致；多重核酸扩增荧光检测和第二代杂交捕获试验的HPV阳性率具有较好的一致性。结论高危型HPV多重核酸扩增荧光检测技术具有较高灵敏度和特异度，与第二代杂交捕获试验相比具有良好的一致性，值得在临床中推广使用。

结核杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术联合干扰素-γ释放试验对肺结核的诊断效能

目的探讨结核杆菌利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测(Gene Xpert-MTB/RIF)技术联合干扰素-γ释放试验(IGRA)对肺结核的诊断效能,为临床治疗提供参考。方法选取2022年3月至2024年3月睢宁县中医院收治的78例疑似肺结核患者的临床资料,进行回顾性分析。所有患者均接受结核分枝杆菌(MTB)培养、Gene Xpert-MTB/RIF、IGRA检查,以MTB培养结果为金标准,分析Gene X-pert MTB/RIF联合IGRA对肺结核的诊断效能。结果MTB培养结果显示:78例疑似肺结核患者中,阳性58例,阴性20例;联合检测结果显示:阳性72例,阴性6例。联合检测准确度为85.90%,灵敏度为94.83%,特异度为60.00%,阳性预测值为91.67%,阴性预测值为66.67%,均高于各项单一检测(均P<0.05)。结论Gene Xpert-MTB/RIF联合IGRA诊断肺结核的价值较高,值得临床应用。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术在肺炎支原体肺炎早期诊断中的价值及影响因素分析

目的评估实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)在儿童肺炎支原体肺炎(MPP)早期诊断中的应用价值及影响因素分析。方法选取2016年12月至2017年12月住院治疗的社区获得性肺炎患儿526例,采用颗粒凝集法检测MP血清学抗体(MP-Ab),并以此结果为参照,评价SAT用于诊断MPP的价值。结果以血清MP-Ab检测结果确诊MPP患儿165例,MP-SAT诊断MPP的敏感度为90.9%(150/165)、特异度为97.9%(368/376),准确性高(约登指数为0.89),两者的一致性好(Kappa=0.90)。MP-SAT在短病程患儿中的诊断敏感度明显高于长病程患儿(P=0.031);MP-SAT诊断敏感度明显高于单次血清MP-Ab(P=0.018),两者的一致性差(Kappa=0.039);MP-SAT与双份血清MP-Ab一致性好(Kappa=0.91)。多因素logistic回归分析结果显示:病程(≥7 d)、院外应用大环内酯类药物治疗是影响MP-SAT检出结果的主要因素(P<0.05)。结论 MP-SAT在MPP的早期诊断中应用价值高,可以有效弥补急性期单份血清MP-Ab检测的不足,辅助临床进行早期诊断;尽可能在病程早期(<7 d)和大环内酯类药物应用前进行MP-SAT检测。

3个X-STR基因座荧光标记复合扩增(英文)

为研究DXS6803、DXS981和DXS68093个基因座多态性及其在法医学中的应用,建立X染色体基因座(DXS6803、DXS981和DXS6809)的荧光复合扩增体系。用荧光标记引物PCR技术复合扩增3个基因座,并用ABIPRISM3100毛细管电泳及其软件进行基因分型。结果在中国汉族340名无关男性个体及195名无关女性个体中,DXS6803、DXS981和DXS6809三个基因座分别发现了13、12、11个等位基因,男性个体共检出183种单倍型,单倍型多样性为0.9926。结果表明这3个基因座有较高的多态性信息,在个体识别和亲权鉴定(特别是在缺失双亲的特殊检案)中有重要的应用价值。