扩环酶的研究进展及其应用前景

扩环酶，也叫脱乙酰氧基头孢菌素Ｃ合成酶，催化青霉素Ｎ 扩环生成脱乙酰氧基头孢菌素Ｃ，是头孢菌素生物合成中的关键酶。在真菌中它是一个双功能酶，同时具有扩环酶和羟化酶的活性；而在细菌中扩环和羟化却是由两个独立的酶来承担的。近年来，扩环酶被纯化成均一蛋白，有关它的性质、分子结构以及基因结构等方面的研究都取得了飞速发展，并不断地应用基因工程的技术探索其在抗生素生产上的应用。

定向改造棒状链霉菌青霉素扩环酶的研究进展

青霉素扩环酶是实现酶法转化青霉素生产各种半合成头孢菌素的关键前体7-ADCA的关键酶。获得对青霉素G具有高催化能力的扩环酶突变体,是将其引入工业化生产需要解决的关键问题。目前利用非理性和理性的方法对改酶进行改造,取得了一些活性提高的突变株。本文对改造青霉素扩环酶的研究进展进行总结,并结合其自身的工作对改酶的进一步研究提供理论基础。

定点突变改造棒状链霉菌青霉素扩环酶

利用定点突变技术对ScDAOCS进行改造,得到3个突变体Q166E、D28E、M73I,生物活性检测和比活力数据表明2个突变体D28E、M73I的催化活性提高,为7-ADCA的合成提供了技术支持。

扩环酶固定化的反应条件研究

为了提高扩环酶的工业化应用,进行扩环酶固定化。固定化酶可以提高游离酶的稳定性,便于回收,且能提高酶的循环利用率。制备扩环酶液后,利用聚乙二醇二缩水甘油醚对扩环酶进行交联固定化,再选大孔吸附树脂HZ832作为载体,进行吸附固定化,进行反应条件对固定化影响实验,检测酶活以筛选出最优的固定化方法。结果表明,交联固定化最佳交联剂用量为50μL,最佳交联温度为30 ℃,最佳交联时间为2 h。吸附固定化最佳酶液加入量为12 mL,最佳缓冲液浓度为1.5 mol/L,最佳吸附温度为35 ℃,最佳吸附时间为6 h。交联吸附法制备的固定化酶酶活为62 U?g,交联吸附法固定扩环酶具有可行性,有较高的工业应用价值。

扩环酶在头孢菌素类抗生素生产中的应用进展

扩环酶是一类典型的铁(Ⅱ)/2-酮戊二酸依赖性双加氧酶,该酶最主要的特点是能将青霉素的五元四氢噻唑环扩环为六元二氢噻嗪环结构,从而生成头孢菌素。文章阐述了扩环酶的来源,并以来自棒状链霉菌的去乙酰氧基头孢菌素C合酶和来自顶头孢霉的去乙酰头孢菌素C合成/羟化酶作为主要研究对象,详细介绍了扩环酶的结构特性、作用机制及酶修饰工作,总结出对青霉素G扩环效率较好的氨基酸位点突变。此外,由于去乙酰氧基头孢菌素C合酶可以将青霉素N扩环生成去乙酰氧基头孢菌素C,去乙酰头孢菌素C合成/羟化酶可以将青霉素N扩环生成去乙酰头孢菌素C,导致两种扩环酶具有不同的工业用途,因此文章还对当前扩环酶的工业应用进展进行总结,为提高酶法生产头孢菌素类抗生素及其医药中间体的产量提供了现实依据。

发酵法制造7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸技术概述

从棒状链霉菌分离出扩环酶基因 ,从顶头孢中分离出扩环酶 /羟化酶基因和酰化酶基因 ,以质粒PSEL ECT为基础构建插入了这些酶基因的新的质粒 ,将重组质粒转入产生青霉素的产黄青霉中。在适当条件下培养转化菌株 ,产生取代的酰基 7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸 ,用适当的酶脱去侧链获得 7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸。

发酵期间顶头孢霉细胞脂肪酸成分的变化与头孢菌素C产量的关系

顶头孢霉的头孢霉素C(CPC)生物合成受到葡萄糖之类碳源的阻遏。受阻遏的关键靶位是催化青霉素N(PenN)扩环转化为脱乙酰氧头孢菌素C(DAOC)的酶——扩环酶。因此,在以葡萄糖作碳源的CPC发酵中,PenN积累增多,CPC产量减少。为了迥避葡萄糖的负调节,在工业生产上往往使用油酸甲酯,豆油或米糠油代替葡萄糖作为生物合成CPC的碳源,以提高CPC产量。