转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因抗虫甘蓝植株的获得

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)栽培品种“京丰”和“迎春”,并分别获得了转基因再生植株。对NPTⅡ的ELISA检测表明,标记基因NPTⅡ已在再生植株中得到有效表达。对转化植株进行Southern blot分子杂交实验进一步证明CpTI基因已整合到甘蓝的基因组。实验室内的叶片离体饲虫及盆栽饲虫试验表明,转基因甘蓝对菜青虫具有一定抗性。实验中还观察到,采用愈伤组织分化途径可以获得较高的转化频率,但嵌合体较多;而直接分芽的途径转化率低,但嵌合体较少。

根癌农杆菌介导豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转入苹果主栽品种

研究建立起一套简单、高效的苹果遗传转化系统。利用根癌农杆菌介导的叶圆片转化法将高效启动子启动的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 (CpTI)转入富士、乔纳金、王林、嘎拉等苹果主栽品种中 ,经卡那霉素抗性、PCR、点杂交、Southern杂交检测证明了 4个品种均获得转化再生植株 。

茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的cDNA克隆与序列分析(英文)

对多种已知植物巯基蛋白酶抑制剂(cystatin)基因的氨基酸序列进行比对分析,根据其高度保守的氨基酸序列设计一对简并引物,并从茶树品种龙井43鲜叶中提取总RNA,用RT-PCR法扩增出-204 bp的cDNA特异片段,然后通过3'/5'RACE的方法,分别扩增出3'端和5'端的序列,从而获得茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的cDNA全长序列,所得序列全长627 bp,编码101个氨基酸,分子量约11.062 KDa.该基因在推测的氨基酸序列中含有巯基蛋白酶抑制剂家族中高度保守的、与其活性有关的QXVXG结构,且经Blast分析表明,该基因序列与其他植物巯基蛋白酶抑制剂基因的氨基酸序列同源性为54%～77%.

水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因转化桑树获得转基因植株的初报

利用基因枪法将水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因 (OC)导入桑树组织 ,经抗性筛选和组织培养获得再生植株 ,通过对转基因植株的PCR Southern杂交及RNA点杂交等检测 ,证实OC基因转化桑树成功 ,为选育抗虫性桑树品种奠定了基础。

豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的克隆

利用 RT- PCR的方法 ,从豇豆种子、子叶及成熟叶片中分别提取 RNA,反转录后以该基因两端的保守序列为引物进行 PCR扩增 ,PCR产物与 p UCm- T载体连接进行克隆 ,蓝白筛选重组子 ,经测序 ,其核苷酸同源性高达 1 0 0 % ,蛋白质同源性达 91 %。本试验同时对该基因的表达时期差异进行了大致检测 ,结果是种子的表达量最高 ,子叶其次 。

新疆杨胰蛋白酶抑制剂基因的克隆与表达

杨树受损伤后能诱导一些基因的表达,其编码的蛋白质可能在杨树的防卫反应中起一定作用。用PCR方法从新疆杨叶片中克隆出一个损伤诱导型Kun itz胰蛋白酶抑制剂基因PaTI1。序列分析表明:此基因不含内含子,其翻译起点上游具有‘TATA’和‘CCAAT’等转录控制元件,包含的阅读框架能编码一个长为213个氨基酸的多肽。此多肽与克隆自美洲山杨的PtTI2和PtTI1氨基酸序列同源性最高,分别为95%和80%,其N端存在一长度为27个氨基酸的信号肽。将此基因以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行表达,纯化后的融合蛋白对胰蛋白酶的活性有抑制作用,每8.5μg融合蛋白可完全抑制1μg牛胰蛋白酶的活性。W estern b lot分析表明融合蛋白与PtTI2特异的抗体之间有明显的血清学反应。

用花粉管通道法将慈姑蛋白酶抑制剂基因(API)导入水稻获得转基因植株

采用花粉管通道法遗传转化技术,将慈姑蛋白酶抑制剂基因(API)导入水稻品系9311中,获得了转基因植株。抗虫性鉴定结果表明:部分转基因植株对水稻螟虫的抗性比对照明显提高;PCR扩增获得了与引物扩增片段长度相同的DNA片段,证实API基因已整合到受体植株的基因组中。遗传分析表明,API基因能在有性生殖过程中传递给后代,并于T4代分离出抗性纯合的株系。

脊尾白虾丝氨酸蛋白酶抑制剂基因克隆及表达分析

采用RACE方法获得了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因的cDNA序列。该基因全长1 516 bp,开放阅读框1 245 bp,编码414个氨基酸,其预测分子量为45.06 kD,理论等电点为5.694,并含有两个糖基结合位点。同源性分析发现其与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性最高,达到49%。组织表达分析表明,serpin基因在脊尾白虾血细胞中表达量最高,其次是肝胰腺和鳃组织,在肌肉中表达量最低。不同盐度胁迫后脊尾白虾的血细胞serpin基因表达量在盐度胁迫8 h时显著高于对照组(P<0.05),肝胰腺组织中serpin基因表达量在盐度胁迫后2 h和24 h出现明显峰值,且显著高于对照组(P<0.05)。上述结果表明,脊尾白虾serpin基因参与了急性盐度胁迫下机体的应激反应。本研究通过克隆脊尾白虾酚氧化酶原激活系统中的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因cDNA全长,分析盐度胁迫后其在血细胞和肝胰腺组织中的表达变化规律,以期为脊尾白虾的健康养殖提供理论基础和参考依据。

转修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)抗虫甜椒植株的获得

以 12～ 14d苗龄的甜椒带柄子叶为外植体 ,经根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介导 ,将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 (sck)导入甜椒杂交种“中椒 5号”和常规种“茄门”中 ,在对甜椒转化系统和芽丛诱导茎伸长的条件进行优化研究后 ,获得了卡那霉素抗性植株 ,最高转化频率为 16 .7% .卡那霉素抗性筛选、PCR检测和Southernblot杂交均证实 ,nptII基因和sck基因已整合进甜椒基因组中 .室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明 ,转基因植株对棉铃虫 (HeliothisarmigeraHubner)具有一定抗性 .图 4表 2参

豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转化芥菜及抗虫鉴定

用农杆菌介导将豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)基因导入芥菜 ,获得了Kan抗性植株 .经PCR扩增、PCR Southern印迹和Northern印迹分析 ,转化再生植株大部分呈阳性 ,而非转化的再生植株均为阴性 ,证明CpTI基因已存在于芥菜基因组中 .在室内进行了喂虫试验 ,结果表明转基因芥菜抗虫性明显高于对照 。

大白菜的马铃薯蛋白酶抑制剂基因转化及抗菜青虫性的鉴定

以大白菜(B.campestrtis ssp.pekinensis)‘北京80号’生长3 d无菌苗的带柄子叶为外植体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法导入马铃薯蛋白酶抑制剂基因(pin Ⅱ)。通过抗性株的真叶在不定芽诱导培养基上的再生, 证实了嵌合体的存在,并通过此方法来消除嵌合体。获得的转基因植株经PCR、PCR-Southern杂交以及植物基因组Southern杂交证实,目的基因已经整合入植物基因组中。对菜青虫(Pieris rapae L.) 进行了转基因大白菜叶片的连续离体饲喂,结果表明:受试的转基因大白菜对菜青虫的生长发育有较明显的抑制作用。

植物蛋白酶抑制剂基因结构、调控及其控制害虫的策略

各种不同类型的植物蛋白酶抑制剂基因已被分离 ,它们的特异产物 (单基因或多基因组合 ) ,对昆虫体内各种生化和生理过程会产生不同程度的影响 ,在对昆虫和病原体防御体系中起重要作用。多种蛋白酶抑制剂重组 ,协同保护植物的方法 ,已成为害虫综合防治计划的一部分。尽管它们近期内尚不能代替化学杀虫剂 ,但可作为有效的替补。目前 ,大多数抑制剂的作用和机理正在详尽地研究中 ,该文综述了植物蛋白酶抑制剂的基因结构、调控与表达并讨论了培育转基因作物控制害虫的策略。

刺桐胰蛋白酶抑制剂基因的构建及表达研究

刺桐胰蛋白酶抑制剂是胰蛋白酶、组织型纤溶酶原激活剂及瑞替普酶特异性的抑制剂 ,可作为配基制成亲合填料用于纯化上述酶。通过化学合成和PCR结合法合成了ETI基因 ,经过序列分析后将其克隆到大肠杆菌表达载体质粒pET32a中 ,并在大肠杆菌中进行诱导表达。表达蛋白分子量同理论值一致 ,生物活性检测表明复性后的ETI对胰蛋白酶及瑞替普酶具有特异抑制作用。

表达马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的Hela细胞的无血清培养

目的:使用无血清培养基培养可稳定表达马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(Brugia malayi cystatin,Bm-CPI)的人宫颈癌细胞(Hela)。方法:将已获得的Bm-CPI稳定转染的Hela细胞株,进行无血清培养并观察Hela细胞的维持时间和培养过程中Hela细胞的形态变化。结果:无血清培养基培养Hela细胞可维持细胞的正常生长。结论:无血清培养基可以逐步代替含血清的培养基,为后续Hela细胞扩大培养和Bm-CPI基因重组蛋白纯化提供依据。

转修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)玉米(Zea mays L.)植株的获得及其抗虫性分析

利用基因枪法将修饰的豇豆胰蛋白酶基因 (sck)导入玉米优良自交系E2 8及34 0的胚性愈伤组织中 ,经筛选剂PPT 3次筛选及再生过程 ,获得可育的再生植株。经PCR及Southernblot分子检测 ,证实所获得的再生植株为转基因植株。豇豆胰蛋白酶抑制剂抑制活性检测及抗虫结果显示 :外源基因在植物已获表达 ,部分转基因植株具有较强的抗虫活性。

根癌农杆菌介导的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转化芥菜的研究

为得到具有较强抗虫性的新的芥菜种质资源,用农杆菌介导将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入芥菜,获得了Kan抗性植株。经PCR扩增、PCR Southernblot和Northernblot分析,转化再生植株大部分呈阳性,而非转化的再生植株均为阴性,证明CpTI基因已存在于芥菜基因组中。在室内进行了喂虫试验,结果表明转基因芥菜抗虫性明显高于对照,转基因植株之间存在抗虫性差异。

豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)的克隆及其植物表达载体的构建

用CTAB法提取豇豆叶片总DNA后,根据基因两端的保守序列设计引物,经PCR方法扩增得到CpTI基因,将其克隆到pMD-18T载体上,酶切并测序鉴定,将该基因登陆到GeneBank(NO.EU088405)并进行同源性鉴定,证明该基因为丝氨酸蛋白酶抑制剂基因家族中的一员。在此基础上,将CpTI基因用限制性内切酶BamHⅠ/SacⅠ切下后,克隆到pCUbi1303的UBI启动子和NOS终止子之间。经PCR和酶切鉴定,得到了该基因的真核表达载体pCUbiCpTI1303,为下一步的转基因做好了准备。

血管紧张素转换酶基因和糜酶抑制剂基因多态性与原发性高血压患者左室肥厚的相关性研究

目的 探讨血管紧张素转换酶 (ACE)基因插入 /缺失 (I/D)多态性和Chymase(CMA)基因A/B多态性与原发性高血压患者左室肥厚的关系。方法 应用聚合酶链反应 (PCR)和限制性片断长度多态性方法 (RFLP)检测了 10 4 2例原发性高血压患者ACE基因I/D多态性以及CMA基因A/B多态性 ;同时超声心动测量左室舒张末期内径(LVDd)、舒张期室间隔厚度 (IVST)及左室后壁厚度 (LVPWT)。结果 ①ACE基因II、ID、DD基因型及I、D等位基因频率在原发性高血压合并左室肥厚组 (LVH)与无左室肥厚组 (NLVH)间的分布差异无统计学意义 ;②CMA基因AA、AB、BB基因型及A、B等位基因频率在LVH组与NLVH组间的分布差异无统计学意义 ;③ACE和CMA基因型间年龄、体质指数 (BMI)、脉搏、收缩压 (SBP)、舒张压 (DBP)、LVDd、IVST、LVPWT、LVM以及LVMI差异均无统计学意义 ;④ACE和CMA基因型与左室肥厚 (LVH)不相关 ;⑤ACE基因中各基因型与CMA基因中各基因型间不存在交互作用。结论 ACE基因I/D多态性及CMA基因A/B多态性与原发性高血压患者左室肥厚不相关。

将水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin I)基因导入甘薯品种

本研究采用根癌农杆菌介导法以 12个甘薯品种作为受体材料 ,将OCI (OryzacystatinI)基因导入甘薯品种中 ,获取 7个品种的抗Kan再生植株 ,对获得的具有Kan抗性的再生植株进行PCR分子检测 ,初步结果证明已将外源OCI基因导入到 4个甘薯品种 (6个株系 )的基因组中。