表皮生长因子受体酪氨酸激酶的克隆表达和酶抑制剂筛选模型的构建

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)属受体酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)家族,其胞内的酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中具有十分重要的作用。许多肿瘤的发生、发展都与EGFR胞内酪氨酸激酶的异常表达密切相关。因此,EGFR胞内酪氨酸激酶的抑制剂有可能成为治疗肿瘤的有效药物。从人脐静脉内皮细胞(HUVEC)提取总RNA,采用RT-PCR获得EGFR酪氨酸激酶催化域的编码基因。将其克隆至载体pET-30a,在E.coliBL21(DE3)中进行了成功表达,采用Ni-NTA亲和层析对其进行了纯化。通过对酶的活性的测定,证明重组EGFR酪氨酸激酶蛋白具有利用ATP催化底物发生磷酸化反应的激酶活性。以该重组激酶为靶位构建了酶抑制剂筛选模型,拟对微生物代谢产物进行筛选。

基于Caco-2细胞裂解液的DPP-4抑制剂筛选方法的建立

使用结直肠腺癌Caco-2细胞裂解液对西格列汀的DPP-4抑制率和抑制类型进行测定,建立体外筛选DPP-4抑制剂的模型。将成熟分化的Caco-2细胞于Tris-HCl缓冲液内超声破碎制成细胞裂解液,以甘氨酰-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Gly-Pro-AMC)为底物对裂解液中DPP-4的比活力进行测定。以Gly-Pro-AMC为底物、稀释后的Caco-2细胞裂解液为DPP-4酶溶液,使用一系列底物浓度测得西格列汀对DPP-4抑制的IC50,使用双倒数作图法在一系列底物以及抑制剂浓度下测得西格列汀的抑制类型。在实验条件下测得西格列汀的IC50为18.68 nmol/L(95%CI,15.44~21.90 nmol/L)(拟合曲线R^(2)>0.99),抑制类型为竞争性抑制(拟合曲线R^(2)>0.99)。测得模型条件下的酶反应动力学参数Km为(75.11±2.15)μmol/L,Vmax为(1.00±0.03)μmol/(L·min),以及西格列汀的Ki为6.07 nmol/L(95%CI,5.61~6.58 nmol/L)(拟合曲线R2>0.99)。使用该模型测得西格列汀的DPP-4抑制率和抑制类型与文献报道相符,证明该模型可以用于DPP-4抑制剂的筛选。

沙棘粗多糖对α-葡萄糖苷酶活性影响及酶动力学的研究

目的:探讨中国沙棘粗多糖中α-葡萄糖苷酶抑制剂的体外酶动力学的特性。方法:利用酶-抑制剂筛选模型,选择沙棘粗多糖,通过改变其浓度、反应时间、pH条件、温度等进行体外酶学动力学研究。结果:沙棘粗多糖浓度在0.0098～0.625 g.L-1之间时,酶的抑制率随着浓度的增大而升高,IC50为0.031 g.L-1;浓度为0.625 g.L-1时抑制率达92.52%,且与酶结合迅速,酸碱范围广,热稳定性好。结论:沙棘粗多糖是一种高活性的竞争可逆性α-葡萄糖苷酶抑制剂,抑制常数Ki=5.26g.L-1。