TLR4抑制剂TAK-242对高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗的干预作用

目的建立高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠模型,探讨干预Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)对高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗状态的影响。方法首先建立高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠模型。选取出生21 d的雄性C57BL/6小鼠36只,随机分为2组,正常对照组12只,以普通基础饲料喂养(low fat diet,LFD),高脂饮食实验组24只,给予高脂饲料喂养(high fat diet,HFD)。待2组小鼠体质量出现显著差异时,进行葡萄糖耐量实验(glucose tolerance test,GTT)和胰岛素耐量实验(insulin tolerance test,ITT)观察小鼠胰岛素抵抗的发生。小鼠胰岛素抵抗模型建立后,观察TLR4抑制剂TAK-242对小鼠胰岛素抵抗状态的作用。LFD组小鼠继续以基础饲料喂养(即作LFD对照组);HFD组小鼠随机分为2组,每组12只小鼠,均继续以高脂饲料喂养,其中一组HFD小鼠腹腔注射TLR4抑制剂TAK-242,以0.5 mg TAK-242/kg体质量的计量给予,每周2次(即给予TAK-242的高脂饮食实验组,HFD-T组);另一组HFD小鼠作为单纯高脂饮食的胰岛素抵抗空白对照组(HFD-C组),只给予等体积的溶媒-二甲基亚砜(DMSO)。给予小鼠TLR4抑制剂5个月,进行GTT和ITT后,处死小鼠。采用EDTA-K2抗凝管收集血液标本,立即分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和血浆。应用Western blot技术检测PBMC TLR4蛋白表达水平。采用全自动生化分析仪测定血浆葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的水平。结果在小鼠胰岛素抵抗模型建立期间,与对照组相比,高脂饮食组小鼠体质量增长较快,喂养至第20周体质量出现显著差异(P<0.05);持续高脂饮食7个月,GTT和ITT结果显示,高脂饮食组小鼠对糖的调节能力受损、对胰岛素的降糖作用减低,说明高脂饮食诱导小鼠胰岛素抵抗成功。出现胰岛素抵抗的小鼠,在给予TLR4抑制剂TAK-242 5个月后,对葡萄糖的调节能力和对胰岛素的敏感性均有所改善。血浆生化指标结果显示,与对照组比较,单纯高脂组和给予TAK-242的高脂饮食干预组小鼠血浆TG、TC、LDL-C浓度均显著升高(P<0.05),GLU、HDL-C、ALT水平均有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05)。单纯高脂组和TAK-242干预组比较,血浆GLU、TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT水平在2组之间不存在显著性差异(P>0.05)。Western blot实验结果发现,正常对照组小鼠PBMC未见TLR4蛋白表达,单纯高脂饮食组小鼠PBMC有高水平的TLR4蛋白表达,给予TAK-242的高脂饮食小鼠PBMC TLR4蛋白虽有表达,但表达量明显低于单纯高脂饮食组小鼠,结果提示TAK-242部分抑制了高脂饮食喂养小鼠PBMC TLR4蛋白的表达。结论高脂饮食成功诱导了小鼠产生胰岛素抵抗,抑制TLR4蛋白的表达可以改善小鼠胰岛素抵抗状态。该研究结果丰富了胰岛素抵抗发生的机制,为进一步深入研究TLR4及其信号通路在胰岛素抵抗中的作用提供了实验依据。

胆碱酯酶抑制剂TAK-147对大鼠空间记忆的作用

目的 :评价一个新的胆碱酯酶抑制剂 TAK- 14 7对大鼠空间学习记忆的作用。方法 :用水迷宫来评价大鼠空间学习记忆 ,用开场实验方法来分析大鼠的自发活动能力。结果 :在学习过程中 ,腹腔内注射东莨菪碱 (0 .4mg/ kg)明显造成了大鼠空间学习记忆障碍 ,延长了其上台潜伏期。腹腔内注射 TAK- 14 7能剂量依赖性地改善东莨菪碱造成的学习障碍 ,在 0 .3和 1.0 mg/ kg的剂量具有显著性意义。在记忆再现过程中 ,由东莨菪碱 (1.5 mg/kg)造成的上台潜伏期延长也分别被 TAK- 14 7(0 .3mg/ kg和 1.0 mg/ kg)和他克林 (3.0 mg/ kg和 5 .0 mg/ kg)明显逆转 ,且 TAK- 14 7的作用强于他克林。在开场实验中 ,TAK- 14 7组与东莨菪碱组或生理盐水组比较 ,自发活动能力没有明显改变。结论 :TAK- 14 7作为一个新的胆碱酯酶抑制剂 ,能明显改善东莨菪碱造成的大鼠空间学习记忆障碍。

泛素激活酶抑制剂对猪精子获能状态、膜重构及体外受精的影响

【目的】评估泛素激活酶(E1)对猪精子获能、膜重构和体外受精的影响。【方法】选取5头长白猪采集精液,以硫醇酯法评估泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme, E1)抑制剂(TAK-243)对精子中泛素(ubiquitin, Ub)与E1结合的影响;将精子分为鲜精组(Fresh)、DMSO组(DMSO)、获能组(Capacitated)及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243组,鲜精组用2 mL PBS重悬精子沉淀;获能组用2 mL获能液重悬精子沉淀;DMSO组及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243组分别用2 mL含0.07%DMSO及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243的获能液重悬精子沉淀,使用微生物动(静)态图像检测系统检测精子的动力学参数;以Western blotting法检测精子的酪氨酸磷酸化水平;Zn2+荧光探针检测精子的Zn2+含量;花生凝集素染色检测精子的顶体膜重构;免疫荧光法检测顶体表面精子黏附蛋白(AQN-1、AWN)的表达;体外受精法检测TAK-243对精卵结合和卵裂率的影响。【结果】硫醇酯分析结果表明,TAK-243处理组精子未形成Ub-E1复合物,说明TAK-243抑制了E1对Ub的激活作用。与鲜精组相比,获能组精子的曲线速度(VCL)和平均鞭打频率显著升高(P<0.05)。3个浓度TAK-243组与获能组精子的各项动力学参数差异均不显著(P>0.05)。与获能组相比,3个浓度TAK-243组酪氨酸磷酸化水平均显著降低(P<0.05),且随着TAK-243浓度的增加,精子蛋白的酪氨酸磷酸化水平逐渐降低。后续试验使用7.2 nmol/L TAK-243进行精子中Zn2+水平和顶体膜重构的研究,其结果表明,与获能组相比,7.2 nmol/L TAK-243组Zn2+水平、顶体膜完整性及AQN-1和AWN蛋白的表达水平均显著增加(P<0.05),精子与卵母细胞的黏附率和卵裂率均显著降低(P<0.05)。【结论】7.2 nmol/L TAK-243显著降低了精子获能期间蛋白酪氨酸磷酸化水平、精卵结合率和卵裂率,显著增加了Zn2+含量、顶体膜完整率及顶体表面蛋白AWN和AQN-1的表达,说明泛素-蛋白酶体信号通路参与了精子的体外获能。

TAK242阻断Toll样受体4通路在脓毒症中对肝脏起到保护作用

目的探讨Toll样受体4(TLR4)特异性抑制剂TAK242对脓毒症大鼠模型肝脏的保护机制。方法将18只雄性SD大鼠按随机数字表法分为3组,每组6只,采用腹腔注射脂多糖(LPS)15 mg/kg制备脓毒症模型;TAK242干预组于制模前腹腔注射TAK242(5 mg/kg)进行预处理,脓毒症模型组和对照组则注射等量溶剂〔10%二甲基亚砜(DMSO)+90%玉米油〕。6 h后取大鼠腹主动脉血,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平;处死大鼠取肝组织,采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测各组大鼠肝组织TLR4、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、核转录因子-κB p65及其磷酸化(NF-κB p65,p-NF-κB p65)的表达水平,采用免疫组织化学(免疫组化)染色观察肝组织NF-κB p65蛋白表达,采用苏木素-伊红(HE)染色评估肝细胞损伤情况。结果脓毒症模型组ALT和AST水平均较对照组显著升高〔ALT(μg/L):26.639±7.814比2.847±2.150,AST(μg/L):28.442±8.417比5.779±3.019,均P<0.01〕,TAK242干预组ALT和AST水平则较脓毒症模型组明显降低〔ALT(μg/L):7.269±3.398比26.639±7.814,AST(μg/L):3.580±3.115比28.442±8.417,均P<0.01〕。光镜下显示,脓毒症模型组肝细胞排列紊乱,细胞水肿明显,炎症细胞浸润增多;TAK242干预组肝细胞排列整齐,肝细胞水肿明显减轻,炎症细胞浸润减少。Western blotting结果显示,脓毒症模型组肝组织caspase-3蛋白表达较对照组明显升高(caspase-3/GAPDH:0.794±0.164比0.482±0.055,P<0.05),TAK242干预组caspase-3蛋白表达则较脓毒症模型组明显降低(caspase-3/GAPDH:0.482±0.056比0.794±0.164,P<0.05),说明TAK242可减轻脓毒症大鼠肝脏细胞凋亡。脓毒症模型组肝组织IL-6、TNF-α和TLR4蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均明显高于对照组(IL-6/GAPDH:1.442±0.204比1.019±0.024,TNF-α/GAPDH:1.089±0.098比0.806±0.005,TLR4/GAPDH:1.292±0.085比0.941±0.087,p-NF-κB p65/NF-κB p65比值:1.936±0.081比1.579±0.183,均P<0.05),TAK242干预组肝组织IL-6、TNF-α和TLR4蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均较脓毒症模型组明显降低(IL-6/GAPDH:1.035±0.042比1.442±0.204,TNF-α/GAPDH:0.572±0.096比1.089±0.098,TLR4/GAPDH:0.984±0.078比1.292±0.085,p-NF-κB p65/NF-κB p65比值:1.484±0.255比1.936±0.081,均P<0.05),说明LPS诱导的脓毒症可激活肝组织TLR4/NF-κB通路所介导的炎症反应,给予TAK242阻断TLR4通路后,TLR4/NF-κB通路的激活被抑制,从而减轻脓毒症大鼠肝组织的炎症反应。免疫组化染色显示,脓毒症模型组肝组织NF-κB p65阳性表达较对照组明显增加;TAK242干预组NF-κB p65阳性表达则较脓毒症模型组明显减少,细胞核内几乎无阳性表达。结论TAK242通过阻断肝脏TLR4/NF-κB通路可减轻脓毒症大鼠的肝功能损伤,起到保护肝脏的作用。

TAK242阻断TLR4通路起到对脓毒性心肌损伤和心功能障碍的保护作用

目的探讨Toll样受体4(TLR4)通路在脓毒症大鼠心肌损伤和心功能障碍中的作用。方法将18只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为对照组、脂多糖(LPS)组和TLR4特异性抑制剂TAK242预处理组(TAK242+LPS组),每组6只。通过腹腔注射LPS 15 mg/kg诱导脓毒性心脏功能障碍大鼠模型;对照组给予等量生理盐水。TAK242+LPS组在给予LPS刺激前3 h腹腔注射3 mg/kg TAK242〔以0.2 g/L溶于10%二甲基亚砜(DMSO)+90%玉米油中〕;对照组和LPS组给予等量10%DMSO+90%玉米油。注射LPS后14 h采用心脏多普勒超声检查各组大鼠心功能。取腹主动脉血,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清心肌肌钙蛋白(cTn)水平。取心肌组织,苏木素-伊红(HE)染色后,光镜下观察大鼠心肌组织形态学改变;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测心肌组织中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达;采用免疫组化法观察心肌组织中TLR4的表达;采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测心肌组织中TLR4、核转录因子-κB p65(NF-κB p65)及其磷酸化(p-NF-κB p65)水平。结果①心功能及心肌损伤:心脏多普勒超声显示,LPS组大鼠左室舒张期末容积(LVEDV)、左室收缩期末容积(LVESV)明显高于对照组,左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)明显低于对照组;光镜下可见心肌细胞变性坏死和炎性细胞浸润,且血清cTn水平均较对照组明显升高,说明LPS诱导的脓毒症可引起心功能障碍和心肌损伤。而给予TAK242预处理阻断TLR4通路对脓毒症时的心功能和心肌有保护作用,表现为TAK242+LPS组LVEDV和LVESV均较LPS组明显降低〔LVEDV(μL):71.25±21.16比118.01±11.89,LVESV(μL):9.57±5.75比32.70±9.22,均P<0.01〕,LVEF、LVFS较LPS组明显升高〔LVEF:0.868±0.075比0.722±0.095,LVFS:(59.88±8.46)%比(42.37±8.71)%,均P<0.05〕,心肌组织损伤明显减轻,且血清cTn水平较LPS组明显降低(μg/L:107.85±21.38比152.25±27.46,P<0.05)。②炎症指标:qPCR、Western blotting及免疫组化显示,LPS组大鼠心肌组织中IL-6和TNF-α的mRNA表达、TLR4蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均明显高于对照组,说明LPS诱导的脓毒症可激活心肌组织中TLR4/NF-κB通路介导的炎症反应。给予TAK242阻断TLR4通路可抑制TLR4/NF-κB通路,从而减轻脓毒症大鼠心肌组织炎症反应,表现为TAK242+LPS组心肌组织IL-6和TNF-α的mRNA表达、TLR4蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均较LPS组明显降低〔IL-6 mRNA(2^(-ΔΔCT)):10.44±3.30比107.50±29.48,TNF-αmRNA(2^(-ΔΔCT)):2.38±0.68比3.77±0.56,TLR4蛋白(TLR4/GAPDH):0.39±0.01比0.58±0.04,p-NF-κB p65/NF-κB p65比值:1.21±0.11比2.10±0.18,均P<0.05〕。结论TAK242可通过阻断TLR4信号通路介导的炎症反应来保护LPS诱导的脓毒性心功能障碍和心肌损伤。