一种以病毒作为刺激剂的抑制性寡聚脱氧核苷酸筛选方法的建立

目的:研究人工合成的寡聚脱氧核苷酸(ODN)对人体抗病毒免疫反应的抑制作用,为开发具有免疫调节功能的新型ODN提供筛选平台。方法:将热灭活的人单纯疱疹病毒I型(HSV-1)和流感病毒PR8株(PR8-Flu)作为刺激物,同时以已知的免疫抑制性ODNIRS954作为抑制物,用生物学检测方法分析病毒与ODN共同作用的人外周血单个核细胞(PBMC)培养上清的抗病毒活性,并优化各项实验条件。结果:IRS954能显著抑制HSV-1和PR8-Flu诱导的人PBMC的抗病毒活性。在该实验条件下,自行设计的ODN显示出不同的免疫抑制活性。结论:具有一定序列特点的ODN能够抑制由DNA或RNA病毒诱导的人体抗病毒免疫,该实验方法为研究开发新型免疫调节性ODN奠定了基础。

利用CAL-1-L929细胞建立一种抑制性寡聚脱氧核苷酸筛选体系

目的利用树突状细胞CAL-1的肿瘤坏死因子-α（TNF—α）检测平台，以进一步应用于抑制性寡聚脱氧核苷酸的筛选。方法以含有未甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸CpG（CpGODN）0800（3μg／ml）作为刺激剂，将其作用CAL-1细胞（2×10^5个细胞／孔），48h后收集上清，作用于L929细胞（2×10^4个细胞／孔））。培养18h，加入水疱性口炎病毒（VSV），培养72h，检测570nm处的吸光度值。结果筛选条件确定为CpGODN0800终质量浓度为3μg／ml，CAL-1上清液1：5倍稀释。L929细胞数在2×10^4个细胞／孔），反应时间为24h。应用此条件成功筛选小自行设计的抑制性ODN—SAT05f。结论建立实验体系，成功检测了自行设计的抑制ODN和CpGODN诱导的CAL-1细胞的TNF—α的生物学活性。

Survivin反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞生长的抑制

目的：观察survivin反义寡聚脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynueleotide，ASODN）对人胃癌细胞株SGC-7901的抑制作用。方法：用ASODN与人胃癌细胞SGC-7901共同温育一定时间后，PCR检测ASODN处理后肿瘤细胞survivin mRNA的表达，倒置显微镜、电镜观察细胞生长形态变化，DNA电泳检测细胞DNA片段化分布，流式细胞术检测ASODN作用后人胃癌细胞SGC-7901的凋亡，TRAP法测定细胞端粒酶活性，MTT法检测ASODN对胃癌细胞增殖的抑制；上述实验以胃癌细胞不加ASODN和加无关寡聚脱氧核苷酸为对照。结果：ASODN作用后，肿瘤细胞survivin mRNA的表达受到明显抑制。survivin ASODN能诱导人胃癌细胞凋亡，在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成；电泳呈凋亡特征性ladder条带；流式细胞术分析显示，在G1期前出现亚2倍体凋亡峰，肿瘤细胞凋亡率显著增高[（7．01±0、21）％ vs （25．00±0．52）％，P〈0．01]。ASODN作用后SGC-7901细胞端粒酶活性明显受到抑制（P〈0．01）。ASODN作用能明显抑制胃癌细胞的增殖，而且随ASODN浓度的增加（2×10^-5－5×10^-5mol／L）和作用时间延长（24－96h）而加强（P〈0．05或P〈0．01）。结论：survivin反义寡聚脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡，从而抑制胃癌细胞的增殖。

CpG寡聚脱氧核苷酸抑制人膀胱癌细胞在裸鼠体内的生长

目的:观察不同剂量的CpG ODN 1668对裸鼠皮下接种人膀胱移行细胞癌T24细胞生长的抑制作用,并与卡介苗的作用进行比较。方法:通过皮下接种T24细胞,建立裸鼠皮下接种人膀胱癌细胞的动物模型。将裸鼠随机分为5组,(1)对照组;(2)BCG组;(3)小剂量CpG ODN 1668组;(4)中等剂量CpG ODN 1668组;(5)大剂量CpG ODN 1668组。自肿瘤细胞接种后第1天起给药,共4次(第1、8、15、22天),在肿瘤周围多点注射相应药物(早期给药);同样方式另设5组动物,自肿瘤细胞接种后第7天起(第7、14、21、28天)于肿瘤周围多点注射相应药物(延迟给药)。观察肿瘤体积和裸鼠的生存率。结果:早期给药时,在CpG ODN 1668各剂量组和BCG组,肿瘤生长均被抑制,裸鼠的生存期得到延长。中等剂量和大剂量CpG ODN 1668组对肿瘤细胞生长的抑制作用强于BCG组。延迟给药时,CpG ODN 1668各剂量组肿瘤体积和裸鼠的生存率,与对照组和BCG组的差异无显著统计学意义。结论:CpG ODN 1668的早期应用,可抑制人膀胱癌细胞T24在裸鼠体内的生长,并表现为剂量依赖性;其抗肿瘤效应是非T细胞依赖的。当加大使用剂量时,CpG ODN 1668对膀胱癌细胞生长的抑制作用强于BCG。而当肿瘤负荷较大时,CpG ODN 1668和BCG的延迟使用对膀胱肿瘤细胞在裸鼠体内的生长无抑制作用。

反义寡聚脱氧核苷酸（ODN）衍生物抑制乙肝病毒抗原表达的研究

为比较针对中不同基因的ＯＤＮ硫代衍生物阻断乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的抗原表达，合成了与核心蛋白编码基因起始码上游序列（＃１８９３－１９０７），多聚酶蛋白编码基因起始码上游及内部序列（＃２２９７－２３１３，＃２７９７－２８１３）３．５ｋｂＲＮＡ３′端起始负链ＤＮＡ合成序列（＃ｌ８１７－１８３１）互补的寡聚脱氧核苷酸硫代衍生物［Ｃ－ＯＤＮ，Ｐ－ＯＤＮ，ＰＭ－ＯＤＮ，ＰＢＳ－ＯＤＮ］，分别在ＨＢＶ短暂表达和稳定表达细胞培养系统中观察其抑制ＨＢＶ抗原表达的作用。结果发现，当培养液中ＯＤＮ浓度为２０μｍｏｌ／Ｌ时，四种ＯＤＮ均能抑制ＨｅｐＧ２２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ（乙肝表面抗原）的产生（抑制率分别为：Ｃ－ＯＤＮ，２４．５％；ＰＯＤＮ，１３．４％；ＰＭ－ＯＤＮ，３８．４％；ＰＢＳ－ＯＤＮ，２８．４％）；与ＨＢＶＤＮＡ双体质粒共转染ＨｅｐＧ２细胞后部分ＯＤＮ可明显抑制ＨＢＶＤＮＡ在细胞内表达（ＨＢｅａｇ分泌抑制率分别为：Ｃ－ＯＤＮ，５２％；ＰＭ－ＯＤＮ，７０％；Ｐ－ＯＤＮ，４８％；ＰＢＳ－ＯＤＮ，１８％）。用测定上清中人白蛋白的结果证明，Ｃ－ＯＤＮ的细胞毒作用最低。对Ｃ－ＯＤＮ的作用机理及进一步发展ＯＤＮ的应用也进行了?

bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸抑制HL-60细胞生长的研究

在体外培养中研究了基因的反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleo-tide,ASON)对HL-60细胞生长增殖的影响。根据bcl-2基因cDNA的序列分析,以bcl-2mRNA翻译起始区域前15个核苷酸为作用靶序列,人工合成了15聚ASON片段,同时合成15聚无关寡聚核苷酸(ODN)片段,以作序列特异性对照。把上述ASON和无关ODN片段与HL-60细胞共培养,同时设置空白对照组,作用一定时间后分别测定细胞动力学和~3H-TdR掺入率。实验发现:从3.5—30.0μmol/L的ASON对细胞生长有不同程度抑制作用,低于10μmol/L时抑制作用小,大于10.0μmol/L时抑制作用显著,浓度愈大,抑制程度愈大,而无关ODN作用组的细胞生长状态与空白对照组无显著差别,作用48小时后浓度3.5μmol/L抑制率为6％,而20.0μmol/L时上升为40％;作用96小时后3.5μmol/L的ASON抑制率是5.1％,30μmol/L的抑制率高达67％。相同浓度的ASON作用不同时间后,细胞生长率各不相同,当浓度达到14.0μmol/L时,48小时的细胞生长抑制率达22％,72和96小时的抑制率分别为25％和29.3％。HL-60细胞被ASON处理后,培养体系中死细胞数随时间延长而增加,浓度在10—30μmol/L范围内,死细胞率由2％增到50％,但在无关ODN及空白对照组中未观察到这种现象。

CpG寡聚脱氧核苷酸抑制肾癌细胞增殖及肿瘤生长的体内外实验研究

目的研究CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)在体内外对肾癌细胞增殖及肿瘤生长的抑制作用,并探讨其可能的作用机制。方法采用CCK-8法检测不同浓度CpG ODN1826和non-CpG ODN1982(ODN1982)干预对体外培养人肾透明细胞癌Caki-1细胞增殖的影响。24只BALB/c裸鼠皮下接种Caki-1细胞建立荷瘤裸鼠模型,4d后根据每周1次的治疗方式随机分为对照组(PBS)、ODN1982组(50μg ODN1982)、小剂量CpG ODN1826组(25μgCpG ODN1826)和大剂量CpG ODN1826组(50μgCpG ODN1826),每组6只。于建模后35d处死动物,比较各组荷瘤裸鼠的肿瘤体积、质量及肿瘤组织学改变;体外分离各组荷瘤裸鼠脾淋巴细胞,乳酸脱氢酶释放法检测不同靶标比例(脾淋巴细胞:Caki-1细胞或脾淋巴细胞:小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞)的荷瘤裸鼠脾淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结果 ODN1982对Caki-1细胞的体外增殖活性无显著影响;500μg/mLCpG ODN1826干预可显著抑制Caki-1细胞增殖。至实验终止时点,小剂量和大剂量CpG ODN1826组荷瘤裸鼠的肿瘤体积显著小于ODN1982组和对照组(P<0.05);各组间肿瘤质量比较差异均具有统计学意义(P<0.05);组织学观察显示,小剂量和大剂量CpG ODN1826组肿瘤组织较多炎性细胞浸润。当靶标比例为50:1时,大剂量CpG ODN1826组裸鼠脾淋巴细胞对Caki-1细胞和YAC-1细胞的杀伤活性分别为(9.74±1.16)%和(79.65±5.23)%,显著高于对照组的(7.67±0.22)%和(10.12±3.03)%及ODN1982组的(7.66±0.93)%和(27.60±9.83)%(P<0.05)。结论 CpG ODN对体外肾癌细胞增殖及荷瘤裸鼠肿瘤组织生长均具有明显抑制作用,其机制可能与CpG ODN增强荷瘤裸鼠的固有免疫应答有关。

反义寡聚脱氧核苷酸抑制脑胶质瘤多药耐药基因1的表达

目的研究多药耐药基因1(M D R1)反义寡聚脱氧核苷酸对胶质瘤耐药细胞系C6/adr中M D R1表达的抑制作用。方法以胶质瘤细胞株C6/adr作为胶质瘤体外耐药模型,针对M D R1基因m R NA的A UG起始区-9～+6序列合成反义和相应的正义寡聚脱氧核苷酸,均经硫代磷酸化修饰。反义寡聚脱氧核苷酸(M D R1-AS)序列为5'-CTCCATCA CCAC CTC-3',正义寡聚脱氧核苷酸(M D R1-S)序列为5'-G AG GTG G TG ATG G AG-3'。在脂质体介导下M DR1-A S、M D R1-S转染C6/adr细胞,48h后利用形态学观察和噻唑蓝快速比色法检测M D R1-AS的细胞毒性作用;半定量R T-PCR检测M DR1-A S处理前后的M DR1m RN A的差异表达;流式细胞术分析P糖蛋白(P-gp)的阳性细胞率。结果M D R1-AS对C6/adr细胞无毒性作用;M D R1-AS处理后M D R1m RN A的差异表达由处理前的106%降至30.44%;P-gp阳性表达率亦由处理前的100%降至32.77%。结论M D R1反义寡聚脱氧核苷酸可有效抑制M D R1m R N A及P-gp的表达,从而为基因治疗耐药胶质瘤提供了实验依据,有望开发成为逆转胶质瘤耐药的反义药物。

结合转录因子激活蛋白1的诱杀性寡聚脱氧核苷酸能抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌成纤维细胞胶原表达

目的探讨结合转录因子激活蛋白1的诱杀性寡聚脱氧核苷酸(AP-1 decoy ODNs)对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的心肌成纤维细胞Ⅰ型及Ⅲ型胶原的影响,为高血压心肌纤维化的防治提供理论依据。方法采片用羟脯氨酸比色法测定 SD 大鼠心肌成纤维细胞(CFs)上清胶原合成,分别观察不同浓度的 AP-1 decoy ODNs 对 AngⅡ诱导的 CFs 胶原的合成、Ⅰ型及Ⅲ型 mRNA 的影响。结果①10^(-7) mol/L AngⅡ刺激24 h 后能够显著增加CFs 胶原合成,decoy ODNs 在10～200 nmol/L范围内量-效相关地抑制 CFs 胶原合成,但突变的 decoy ODNs 对CFs 的增殖、胶原合成没有明显的影响。②10^(-7)mol/L Ang Ⅱ作用24 h 后能够显著使 CFs Ⅲ型(1.04±0.07比1.63±0.07,n=3,P<0.05)和Ⅰ型(1.09±0.09比0.20±0.10,n=3,P<0.05)基因表达上调,而100 nmol/L(Ⅰ型0.45±0.05和Ⅲ型0.84±0.04)、200 nmol/L(Ⅰ型0.22±0.06和Ⅲ型0.61±0.07)的 AP-1 decoy ODNs(P<0.05)能够抑制这种作用。突变的 AP-1 decoy ODNs 没有此作用。结论 AP-1 decoy ODNs 通过抑制 Ang Ⅱ诱导的 CFs Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达,从而抑制胶原的合成。

寡聚脱氧核苷酸抑制巨噬细胞NF-κB活性的实验研究

目的观察寡聚脱氧核苷酸(ODN)对THP-1细胞NF-κB核转位及细胞核内结合活性的抑制作用。方法用脂质体将寡聚脱氧核苷酸转入细胞后,以细菌脂多糖(LPS)刺激30min,分别通过免疫细胞化学、电泳迁移率分析(EMSA)和 RT-PCR检测细胞NF-κB的核移位和细胞核内NF-κB结合活性。结果免疫细胞化学显示转入ODN后以LPS刺激, NF-κB表达仍位于细胞浆内,EMSA显示ODN可明显抑制细胞核内结合活性,RT-PCR显示ODN能够明显抑制 NF-κB相关炎性因子TNF-α mRNA的合成。结论ODN能有效抑制THP-1细胞NF-κB的核移位和细胞核内NF-κB 结合活性,从而抑制相关炎性基因的启动和转录。

DNA聚合酶α反义寡聚脱氧核苷酸抑制人胃癌细胞生长的研究

反义药物的研究为肿瘤的特异性治疗开拓了广阔的前景。DNA聚合酶α是真核细胞DNA合成的关键酶,与肿瘤的发生及发展密切相关。我们用DNA聚合酶α(DNA pol-α)mRNA作靶核酸,合成反义聚脱氧核苷酸(ASODN),作用于胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803,结果发现互补于pol-α mRNA翻译起始区的ASODN可特异地抑制二株人胃癌细胞系的生长,而对正常人脐静脉内皮细胞则不起作用。流式细胞仪分析癌细胞G0/1期比率升高,S期及G2M期比率降低,说明ASODN通过抑制DNA pol-α表达而抑制了细胞DNA合成。

免疫抑制剂寡聚脱氧核苷酸(ODN)的研究进展

抑制性ODN的来源包括病毒基因组,哺乳动物染色体端粒,甲基化修饰的双链DNA人工合成的ODN,碱基替换的CG ODN及单核苷酸重复序列。目前已知的ODN多含有15~30个核苷酸,骨架结构大多经过了硫代修饰。它们具有拮抗Toll样受体的功能,从而抑制免疫细胞被内外源性Toll样受体（TLR）的配体激活。随着对抑制性ODN研究的增多,对其研究的热点集中在了应用其治疗TLR活化的相关疾病及自身免疫病。

内皮素反义寡聚脱氧核苷酸抑制肾小球系膜细胞增殖

目的 :应用反义寡核苷酸技术 ,对培养的人肾小球系膜细胞 (glomerularmesangialcells,GMC)进行内皮素 1(endothelin ,ET 1)基因表达的抑制试验 ,探讨ET 1基因表达与GMC增殖效应的关系。方法 :以阳离子脂质体lipofectin介导的基因转移方法 ,将前内皮素原 ppET 1的反义寡聚脱氧核苷酸 (antisenseoligodeoxynucleotide ,As ODN)及其对照序列正义寡聚脱氧核苷酸 (senseoligodeoxynucleotide ,Se ODN)、错配寡聚脱氧核苷酸 (mismatcholigodeoxynucleotide ,Mis ODN)分别导入GMC。通过生物素标记的As ODN显色反应 ,观察寡聚脱氧核苷酸的转移效果 ;用半定量反转录聚合酶链反应 (reversetranscription polymerasechainreaction ,RT PCR)检测寡核苷酸链对GMC的 ppET 1mRNA表达的影响 ;用放射免疫分析 (radioimmunoassay ,RIA)观察寡核苷酸链对GMC的ET 1蛋白分泌的作用 ;用氮蓝四唑盐 (MTT)试验分析寡核苷酸链对GMC增殖的效应。结果 :寡核苷酸链被转移入GMC。10nmol·L-1As ODN抑制了GMC的 ppET 1mRNA表达、ET 1蛋白合成和细胞增殖 (各组P <0 .0 5 )。 结论 :特异抑制GMC的 ppET 1基因表达能够抑制其增殖 ,证实GMC产生的ET 1能刺激GMC自身的增殖 ,ET 1是GMC自分泌炎症介质之一。

c-fos基因的反义寡聚脱氧核苷酸鞘内注入减弱福尔马林引起的大鼠伤害性行为反应及脊髓背角Fos蛋白和强啡肽 A表达的研究(英文)

本研究通过鞘内注射 c-fos反义寡聚脱氧核苷酸 (antisense oligodeoxynucleotide,AS-ODN)封闭背角中 F os蛋白的表达 ,观察了 Fos蛋白合成和慢痛反应的关系 ,并分析 Fos蛋白合成和强啡肽 A(Dyn A)表达之间的关系。实验组动物 (n=5 )鞘内预先注射 c-fos的 AS-ODN(5 0μg,5μl) ,另两个对照组 (每组 n=5 )分别注射等量生理盐水和 AS-ODN的反序核苷酸 (reverseoligodeoxynucleotides,RS-ODN,5 0μg,5μl) ;4h后 ,各组动物均在一侧后肢脚掌皮下注射 formalin(5 % ,5 0μl) ,并立即用计算动物舔拭注射侧后脚掌累计时间的方法 ,检测大鼠的伤害性行为反应 ,行为检测后 1h处死动物 ,用免疫组化方法检查脊髓背角中 Fos蛋白阳性神经元的数量和强啡肽 A(1～ 8)的表达量。结果发现 ,和两个对照组相比 ,实验组动物 Formalin诱发的伤害性行为反应的第二相明显减弱 ,同时 Form alin注射侧背角 F os蛋白样免疫阳性细胞的数量和 Dyn A含量的灰度值明显减少。本研究结果提示 ,外周伤害性刺激引起的长期持续的痛反应是以 c-fos基因表达增加及受其调控的 Dyn A表达上调为基础的 ,由此推测在脊髓背角神经元中 Fos蛋白和 Dyn

反义ras寡聚脱氧核苷酸对血管平滑肌细胞生物学行为的影响

为了研究调控小分子G蛋白（ras蛋白）以抑制血管平滑肌细胞对生长因子的反应机制，用合成的反斗ras寡聚脱氧核苷酸作用于碱性纤维母细胞生长因子以刺激培养的大鼠血管平滑肌细胞，通过鼠标胸腺嘧啶脱氧核苷酸掺入法及免疫细胞化学方法，来观察反斗ras聚脱氧核苷酸对在碱性纤维母细胞生长因子刺激下的大鼠血管平滑肌细胞DNA合成和增殖细胞核抗原的影响。结果发现，反义ras寡策脱氧核苷酸可明显抑制血管平滑肌细胞DNA的合成，作用12h和24h的抑制率分别为92％和90％；而相同浓度的正义链组仅呈现较弱的抑制作用（P＜0．01）．反义ras寡聚脱氧核苷酸亦可显著减少血管平滑肌细胞增殖细胞核抗原蛋白的表达．提示该策略的应用有可能解决以生长因子为始因引起的细胞增殖性疾病、经文腔内冠状动脉成形术后再狭窄、动脉粥样硬化及高血压等问题的临床防治．

免疫调节性寡聚脱氧核苷酸筛选方法的建立、优化和应用

目的:建立一套合理而便捷的实验体系,为开发新型免疫调节性寡聚脱氧核苷酸(ODN)提供筛选方法。方法:利用含有CpG基序的免疫刺激性寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)作为刺激物,将人外周血单个核细胞(PBMC)作为研究对象,分别以细胞的增殖程度和刺激上清的抗病毒活性作为检测指标,优化各项实验条件,综合评定寡聚脱氧核苷酸的免疫调节活性。结果:成功建立了由阳性免疫调节性ODNA151抑制CpG ODN诱导的人PBMC增殖及抗病毒活性的筛选方法。结论:免疫调节性ODN筛选方法的成功建立,为下一步研究开发新型免疫调节性ODN奠定了基础。

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对HL-60细胞生长的作用

目的：观察端粒酶反义寡聚脱氧核着酸对急性髓细胞白血病细胞株HL-60的作用、方法：采用台盼蓝排斥法进行药物敏感试验，流式细胞仪测定凋亡细胞含量结果：端粒酶反义寡聚脱氧核着酸对HL-60细胞有生长抑制作用，作用具有序列特异性及剂量依赖性．流式细胞仪检测到凋亡峰，含量为28．8％．无关寡聚核着酸片段无此作用．结论：端粒酶对维持白血病细胞的生长可能起十分重要的作用，它有可能成为白血病治疗的新靶点．

含CpG寡聚脱氧核苷酸对肿瘤抗原肽P815AB的免疫佐剂效应研究

目的 以肿瘤抗原P815AB抗原肽为模式抗原 ,研究CpG寡聚脱氧核苷酸 (CpGODN)对该肿瘤抗原表位肽的免疫佐剂效应。方法 用 [3H ] TdR掺入法研究CpGODN体外刺激小鼠脾细胞增殖效应 ,用ELISPOT和 [3H] TdR释放法检测不同构成形式的疫苗在体诱发特异性CTL应答的效应。结果 ODN182 6在体外可刺激小鼠脾细胞显著增殖。经 4次免疫 ,在“肽 +ODN182 6 +IFA”组中 ,4/6的小鼠体内出现了特异性CTL应答 ;在“肽 +ODN182 6 +PBS”组 ,有 3只小鼠在完成 4次免疫前先后死亡 ,余 3只中有 1只体内也可检测到相应CTL反应 ;而对照“肽 +IFA”组 ,6只小鼠体内均未诱发出特异性CTL应答。结论 CpGODN对P815AB表位肽有较为理想的免疫佐剂效应 ,但疫苗构成形式对其免疫效果有着决定性的作用 ,“肽 +ODN182 6 +IFA”是本研究中最有效的疫苗形式 。

寡聚脱氧核苷酸介导的体外多点定位突变——五点定位突变法改造枯草杆菌蛋白酶E基因

用５个化学合成的寡聚脱氧核苷酸片段作为诱变引物，对枯草杆菌蛋白酶Ｅ基因（ＡｐｒＥ）同时进行体外诱变．转化子经打点杂交及温度梯度洗膜法筛选出了若干在５个预定位点同时突变了的突变子，其突变效率达到５０％．同时还得到了１个四点突变的突变子．突变子经ＤＮＡ测序分析。

CpG寡聚脱氧核苷酸在肿瘤免疫治疗中的应用进展

CpG寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)具有激活机体免疫系统的作用。CpG ODN能够直接诱导浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell,pDC)的活化和成熟,促进Th1型细胞因子的分泌和B细胞分化成浆细胞。CpG ODN作为肿瘤疫苗的佐剂已应用于多个临床试验中。单独应用CpG ODN具有抗肿瘤作用,联合其他抗肿瘤治疗(如单克隆抗体、化学治疗、放射治疗和细胞因子等)具有协同抗肿瘤作用。虽然在应用CpG ODN治疗ⅢB～Ⅳ期非小细胞肺癌(non-small celllung cancer,NSCLC)的Ⅲ期临床试验中,与标准化疗方案相比没有延长患者的中位生存期并发生较严重的不良反应,但是在其他临床试验中CpG ODN具有明确的抗肿瘤作用。CpG ODN在抗肿瘤治疗中的有效性和安全性方面还需要进一步的临床试验证实。