卒中大鼠脑组织抑制性差减文库的构建

目的 :建立抑制性差减文库为获得差异表达基因提供方法。方法 :提取正常组及卒中发作组大鼠全脑组织总RNA ,分离出mRNA。两组mRNA反转录合成cDMA。实验组称为tester,对照组称为driver。限制性内切酶RsaI消化产生平端。将testercDNA分成两份 ,分别连接不同的接头 (Adaptor) ,drivercDNA不连接接头。testercDNA连接好接头以后 ,再和driver进行两轮杂交。第一次PCR时仅有连接不同接头的双链cDNA分子可以呈指数扩增。然后采用巢式引物进行第二次PCR ,进一步减少PCR产物的背景 ,强化差异表达序列。结果 :总RMA经甲醛变性凝胶电泳紫外光下可见 2 8S、1 8S 条带清晰 ,2 8S:1 8S 比值约为 1 5 :1 ,未见降解。双链cDMA经RsaI消化 ,cDNA片段变小。已经扣除的cDMA ,GAPDH晚 5个～ 1 5个循环出现条带 ,说明差减文库得到了有效扣除。结论 :建立大鼠卒中发作及正常大鼠脑组织两个抑制性差减文库 。

干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片SSH文库构建及CkWRKY1基因克隆

为研究柠条锦鸡儿抗旱的分子机制,挖掘干旱响应相关基因,成功构建干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片的抑制性差减杂交(SSH)文库,获得1286条高质量的EST序列,平均长度475bp,拼接得到Unigenes645条。对这些Unigenes进行Blast比对注释后发现很多抗旱相关基因,例如LEA蛋白、DHN蛋白编码基因,MYB、bZIP、WRKY、NAC和bHLH转录因子等。通过RACE技术克隆其中1个WRKY转录因子的cDNA全长,命名为CkWRKY1,GenBank登录号为JX987095。CkWRKY1编码330个氨基酸的蛋白质,氨基酸序列中有1个"WRKYGQK"的WRKY转录因子家族保守序列,属于第Ⅱ类WRKY转录因子。利用实时荧光定量PCR技术检测发现,CkWRKY1基因在干旱处理后mRNA的表达水平明显上升,预示该转录因子可能与柠条锦鸡儿抗旱的分子机制相关。

应用SSH技术鉴定枳抗CTV相关基因

应用SSH技术构建了CTV诱导的枳的正向和反向cDNA文库,经菌液PCR检测,从两个文库中分别随机挑选了100个阳性克隆测序,共获得169条表达序列标签(ESTs).用每条EST序列对应的克里曼丁基因组预测转录序列进行GO功能注释,去除在两个文库中均有出现的ESTs后,共得到与已知基因具有较高相似度,涉及39个特异性表达基因的EST 83条,并对4个特异性表达基因进行了实时定量PCR验证.结果表明:CTV侵染之后,枳启动了相关抗逆防御机制来减少伤害,木质素代谢、RNA干扰、赤霉素、生长素以及光敏色素调控可能在抗CTV中发挥了一定作用.

“班菲”脐橙果皮油斑病相关基因的分析

柑橘油斑病作为一种普遍发生的柑橘病害，严重影响着果实的外观和商品价值。以晚熟脐橙“班菲”为材料，利用抑制差减杂交技术分别构建油斑病诱导的正反向cDNA文库。文库插入片段多在100～700bp之间，从正反向文库中各随机挑取了150个菌液PCR检测为阳性的克隆进行测序，成功获得了有效ESTs序列292条。通过BLASTx序列比对，有165条ESTs找到了55个基因的同源序列，且E值小于1.0×10-3。GO功能归类结果表明：这些差异表达的ESTs主要涉及氧化还原、抗逆防御、生物和非生物胁迫等多种相关的生物学过程，推测油斑病的形成与氧化胁迫有关。

长春花细胞C_(20)hi生物碱超量合成及激素自养的分子机制探讨

以长春花激素自养型细胞株C20hi及其母株C20D为材料,构建抑制性差减cDNA文库,斑点杂交筛选后对阳性克隆进行测序,共得到104个不同的差异表达基因片段。将这些序列在GenBank中进行BLAST比对分析,其中28个与已知基因具有很高的同源性。对部分基因的分析发现长春花细胞C20hi中g10h-like、CrPS(Catharanthus roseus protein S)、HyPRP(hybrid prolin-rich protein)、PNAE(polyneuridine aldehyde ester-ase)-like等基因的差异表达可能与该细胞株生物碱超量合成有关;而细胞色素P45071D和CR5基因的差异表达则可能与其激素自养有关。此外,培养基中2,4-D的缺失引起的TDC等酶活性的增强也可能是C20hi细胞生物碱超量合成及激素自养的原因之一。