抑制性差减杂交PCR:一种寻找有差别表达基因的方法

抑制性差减杂交ＰＣＲ：一种寻找有差别表达基因的方法蒋小陵＊鲁林荣＊＊陈诗书＊郑仲承＊＊（＊上海第二医科大学生物化学教研室，上海２０００２５；＊＊中国科学院上海生物化学研究所，上海２０００３１）测定高等生物（包括人类）基因组序列是一个现实和预期的目标。...

抑制性消减杂交法筛选植入人发角蛋白与单纯脊髓损伤大鼠基因表达的差异

目的:采用抑制性消减杂交筛选植入人发角蛋白大鼠损伤脊髓基因性差异表达。方法:实验于2004-11在汕头大学中心实验室进行。分别从植入人发角蛋白损伤组与单一损伤对照组4thw组织中提取mRNA,反转录成双链cDNA,经RsaI酶切、接头连接、两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链扩增,而后将消减cDNA产物进行T/A克隆和测序分析。结果:所获植入人发角蛋白脊髓损伤组织差异表达基因的消减cDNA产物散布在280～800bp范围。经蓝白筛选和酶切鉴定,共得到232个阳性克隆。对其中20个做测序分析获得了氨基酸转运蛋白系统A2(Ata2)、细胞色素氧化酶Ⅲ(COXⅢ)、抗过氧化物蛋白5(Prd5)、Tap1蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cst3)等5个表达蛋白。结论:prd5、Ata2和COXⅢ分别通过参与脊髓损伤后抗氧化损伤过程,起到抑制自由基、兴奋性氨基酸的产生,减轻Ca离子紊乱的程度,降低了继发性损害对脊髓组织的二次损伤程度;而Tap1蛋白和Cst3则参与人发角蛋白的降解过程。

抑制性消减杂交法构建甲状腺癌差异表达基因文库

目的 筛选并克隆在甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的基因。方法 (1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差示表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性高/低表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析。结果成功构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,对其中数个克隆的插入cDNA片段进行测序,经检索Genbank表明,正向SSH产物中有3个片段与来源于结肠上皮腺癌和Lung Epidermoid carcinoma的:EST有100％同源性,提示它们来自恶性肿瘤相关基因。反向SSH产物中有5个片段为未知新序列,提示它们可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因。结论通过抑制性消减杂交技术,构建了人甲状腺癌cDNA消减文库,为下一步筛选鉴定甲状腺癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等工作打下了基础。

抑制性差减杂交方法介绍

抑制性差减杂交方法是一种新的鉴别差异表达基因的方法。它以抑制性PCR为原理 ,选择性扩增差异表达的靶片段 ,具有简便易行、灵敏度高、重复性好等诸多优点。

抑制性差减杂交方法克隆重力适应相关基因

采用抑制性差减杂交方法 ,分别从经重力环境改变适应性锻炼 (实验组 )和未经重力环境改变适应性锻炼 (驱动组 )的两组SD大鼠的淋巴细胞中分别提取RNA和mRNA ,并经逆转录酶合成dscDNA ,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分为 2组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与驱动组cDNA进行 2次消减杂交及 2次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 .随机挑选 80个克隆 ,通过斑点杂交 ,初步筛选出 2

用抑制性差减杂交构建新疆Kaposi肉瘤差异表达基因文库

目的:分离卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS)差异表达基因,并建立相应的cDNA文库,为从分子水平揭示KS发病机制打下良好基础.方法:采集KS肉瘤及来源于同一患者的正常皮肤组织,抽提总RNA,逆转录酶合成dscDNA,经Rsa I酶切,与2种不同的接头衔接,分别以正常组织和肿瘤组织作为tester和driver,进行双向抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH),初步筛选KS肉瘤与正常皮肤差异表达基因,将差异基因PCR扩增,产物与pGEM-Teasy克隆载体连接,转化DH5α大肠杆菌,采用蓝白斑筛选,获得白色阳性克隆菌落,并煮沸破菌,PCR扩增出未知基因片段.结果:差减得到差异基因片段多位于200～500bp,成功构建了2个分别代表在KS肿瘤组织中表达上调和下调的基因文库.结论:经双向抑制性差减杂交获得了KS差异表达基因文库.抑制性差减杂交是一种快速、方便、有效的建立差异基因文库的方法.

抑制性差减杂交(SSH)技术在分离植物差异表达基因中的应用

抑制性差减杂交技术(SSH)是基于抑制PCR作用的cDNA差减杂交,是在转录水平上研究差异基因表达的技术。该技术在一个循环过程中完成差异表达基因丰度的均等化及目标群体和对照群体中相同基因的去除,从而实现差异表达基因的高度富集。一个典型的SSH过程,可在一个差减杂交过程中将稀有基因序列富集上千倍。本文通过详细分析该技术在植物差异表达基因分离中的应用发现:SSH技术主要用于分离组织特异性表达和诱导型表达的基因。首先,SSH技术广泛应用在分离植物发育过程中不同发育阶段和不同组织器官中的组织特异性表达的基因,为揭示植物生长发育过程的分子机理提供了有效手段;另外,在不同植物中,该技术被大量应用于分离各种生物及非生物胁迫条件下诱导表达的抗性相关基因,可以揭示植物抗逆的分子机理。目前,SSH技术已开始应用于分离与次生代谢产物合成相关的基因。SSH技术是分离植物差异表达基因,揭示植物复杂生命现象分子机理的有效方法,将在植物差异表达基因研究中得到更广泛的应用。

抑制性消减杂交方法克隆棉属突变材料腺体发育相关的cDNAs

该文采用抑制性消减杂交方法 (SSH)构建了棉属突变材料“湘棉 18”种子萌发过程中腺体发育形成前后的两个不同时期的SSH差减文库 .通过差示筛选及反式Northern检测 ,获得了色素腺体形成时期特异表达或优势表达的cDNA片段 .结果表明 ,这些cDNA所涉及的基因 ,多数是棉属中新发现的 ,它们与发育调控、细胞凋亡、蛋白质合成等密切相关 .

应用抑制性差减杂交技术分离椪柑枯水相关基因

【目的】探索椪柑枯水分子机理,寻找柑橘枯水应答基因,为柑橘枯水防治奠定基础。【方法】利用抑制性差减杂交技术以椪柑正常果肉cDNA作为Driver,以枯水果肉cDNA作为Tester构建正向差减文库。【结果】挑选了300个有效克隆进行测序分析,260个测序成功。经BLASTx比对分析,197条表达序列标签(ESTs)找到了分属于52个基因的同源序列;63条ESTs同源性较低或没有同源性。对文库中编码β-微管蛋白、衰老相关蛋白、细胞色素c、半胱氨酸蛋白酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、转运蛋白、天冬氨酸蛋白酶前体、WRKY转录因子21的基因进行实时定量RT-PCR验证,结果显示这8个基因均明显上调表达。这些差异性表达基因主要涉及衰老、抗逆防御、几丁质和细胞壁代谢、蛋白降解等过程。【结论】通过构建椪柑果肉枯水正向文库,得到一些与枯水相关的基因,这些基因反映了果实对枯水的调控情况,可作为今后防治枯水病害的候选基因。

应用抑制差减杂交法分离玉米幼苗期叶片土壤干旱诱导的基因

【目的】分离土壤干旱胁迫条件下玉米幼苗期叶片诱导表达的基因。【方法】本研究利用抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)的方法,以耐旱自交系CN165为材料,构建了土壤干旱胁迫下玉米幼苗叶片的正向抑制差减cDNA文库。【结果】在这个文库中,随机挑取了672个阳性克隆,并进行PCR验证,对所有的单克隆进行了测序。得到了598个有效序列,经过EST聚类分析后,共得到了80个uniESTs。其中57个为contigs。23个为singlets。BLASTN的结果表明,所有的uniESTs都可以在玉米的核酸数据库中找到同源序列。BLASTX的结果表明:68个uniESTs和已知功能的蛋白有高度的相似性,8个uniESTs为未知功能蛋白和假定蛋白,4个uniESTs没有蛋白质的相似性。【结论】在这个cDNA文库中发现了大量抗旱相关的基因,这些基因涉及到植物代谢的多种途径。

干旱胁迫下黄花苜蓿与蒺藜苜蓿两个抑制性差减杂交文库的构建及分析

水分胁迫是植物面临的最主要的非生物胁迫之一,研究植物的抗旱机理以提高植物的抗旱能力具有重大的意义。抑制性差减杂交是一种筛选特异表达基因的良好手段,使用该方法成功构建了豆科植物黄花苜蓿和蒺藜苜蓿2个差减文库并进行测序。通过GO分类和KEGG分析等手段对文库中序列进行分类,并分析表达序列的差异,发现黄花苜蓿文库中对抵抗水分胁迫起积极作用的基因表达序列明显多于蒺藜苜蓿。此外,还对筛选到的2个基因在2种苜蓿中的干旱响应表达模式进行了分析,结果表明,在黄花苜蓿中这2个基因的表达更加有利于响应和抵抗干旱。这些结果在分子层面上一定程度的解释了黄花苜蓿较蒺藜苜蓿更加抗旱的原因。

细菌攻毒杂色鲍血淋巴细胞抑制性差减杂交文库构建及巨噬细胞表达蛋白cDNA的克隆与差异表达

以雌性杂色鲍为对象,以大肠杆菌、副溶血弧菌、溶壁微球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的混悬液做为攻毒菌,利用抑制性差减杂交(SSH)技术构建细菌攻毒的杂色鲍血淋巴细胞SSHcDNA文库。随机挑取生长菌落110个克隆子,进行菌液PCR鉴定,计算文库重组率为98.18%,文库容量为1.37×106pfu。将重组子测序,经BLAST一致性搜索比对分析,有一重组片段含有穿孔素(Perforin)保守结构域,为巨噬细胞表达蛋白(MEP)类穿孔素部分cDNA序列,片段大小为1551bp,连续编码517个氨基酸残基,申请GenBank登录号为EU272049。经半定量PCR和荧光定量PCR差异显示分析,发现在细菌感染状态下MEP基因在血淋巴细胞中存在明显的上调表达现象。

用抑制性差减杂交筛选鸭疫里氏杆菌2型可能毒力基因

为寻找鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)可能的毒力基因,以鸭疫里氏杆菌2型(RA2)毒力株RAF2及弱毒力株LY-58为研究对象,通过抑制性差减杂交(SSH)试验,从RAF2株中获得14个特异性差异基因片段。经同源性分析,其中6个差异基因片段分别与外膜蛋白、ATP结合蛋白、转录调节因子、氨基酸通透酶、胞外蛋白编码基因有同源性,为可能的毒力基因;4个差异基因片段与功能未知蛋白或假定蛋白编码基因有关;另外4个差异基因片段未找到同源序列。利用PCR对上述10个可能与毒力相关的差异基因片段在13株分别属于8个不同血清型RA中的分布进行了检测,结果表明除8型外,以上差异基因片段在RA中分布普遍。

鉴别差异表达基因的新方法──抑制消减杂交法(SSH)

抑制消减杂交法（SuppressicSubtractiveHybridization，SSH）是最近（1996）报道的能有效鉴别两个不同细胞群差异表达基因的新方法［1，2］。该方法是以抑制PCR和消减杂交法为基础，在一轮反应中实现mRNA的均等化和消减步骤。本文对SSH法的原理、优缺点作了介绍，并与其它检测差异表达基因的方法，如mRNA差别显示法（DDRT－PCR）、代表性序列差异分析（RDA）比较，认为SSH方法具有高效快速、高敏感性和假阳性低等优点。同时，625个克隆中有很大一部分是转录物丰度很低的基因，40％的克隆可能为新的基因。因此，SSH可作为鉴别差异表达基因和克隆新基因的有效方法。

应用抑制性差减杂交技术构建副猪嗜血杆菌基因组差减文库

为构建副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)有毒力菌株SW124(血清4型)和无毒力菌株H465(血清11型)间的差异表达基因文库,采用抑制性差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)分析SW124和H465菌株细菌基因组的表达差异,并进行两轮差减杂交和两次PCR扩增,将第2次PCR产物与pMD19-T载体相连,转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞并进行文库扩增和蓝白斑筛选,RT-PCR鉴定差异表达文库。结果共获得327个阳性克隆,筛选100个克隆制备质粒进行PCR检测,均扩增出100～2 000 bp大小的片段。差异DNA差减文库的构建为进一步筛选、克隆HPS特异的未知新基因、建立分子鉴别新体系奠定了基础。

抑制性差减杂交技术(SSH)及其应用研究进展

抑制性差减杂交技术是一种差异性基因克隆的新技术,它对研究细胞生殖、发育、分化、衰老及死亡等生命过程中有关基因的差异表达及相关基因的分子克隆提供了有力的技术工具。简要概述了抑制性差减杂交技术的基本原理、优越性、缺陷及其在相关基因克隆方面的应用研究进展。

应用抑制性消减杂交技术筛选三氧化二砷对肝细胞调节的差异表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建As2O3处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆As2O3调节相关基因,阐明As2O3对肝细胞调节作用的分子生物学机制. 方法:以As2O3处理HepG2细胞,同时以PBS处理的相同细胞系作为对照;24 h后制备细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA 消减文库,并转染大肠杆菌J109进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建三As2O3处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到109个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000bp插入片段.挑取含有插入片段的36个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得15种已知基因序列和6个未知功能的新基因. 结论:应用SSH技术成功构建了As2O3处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.

应用抑制性差减杂交技术筛选锦橙CTV应答基因

【目的】探讨易感柑橘衰退病病毒(Citrus tristeza virus,CTV)品种锦橙CTV应答分子机理,筛选和分析CTV应答基因。【方法】以嫁接CTV强毒株TRL514的锦橙阳性材料叶片为试验方(Tester),用嫁接无毒枝条的CTV阴性锦橙叶片为驱动方(Driver),构建CTV侵染的锦橙的正向差减文库。【结果】随机挑选850个阳性克隆测序,其中742条测序成功,去除载体片段和接头序列后得到有效EST 692条。将所有EST序列对应到柑橘的预测基因组转录物,共涉及137个柑橘基因。应用BLAST2GO对这些特异性表达的基因进行功能归类和KEGG分析。结果表明,受CTV侵染的影响,锦橙能量代谢相关基因上调明显,与光合器官碳固定、氮代谢、淀粉和蔗糖代谢等途径相关的EST出现频率较高。另外,与抗逆防御以及苯基丙氨酸合成、类苯基丙烷代谢、类胡萝卜素合成等与植物防御素类物质合成密切相关的代谢途径相关基因较多。【结论】由于CTV的侵染,CTV易感品种锦橙基础代谢改变明显,须通过增强能量代谢和提高自身防御能力来维持自身生长和发育。