抑制性消减杂交分析肌动蛋白细胞骨架和细胞外基质基因在膀胱癌中的表达下调

目的 分析膀胱移行细胞癌的差异表达基因 ,探讨肿瘤行为的分子生物学基础及筛选有效的肿瘤标记。方法 应用抑制性消减杂交 (SSH)方法构建在正常膀胱组织和膀胱癌组织中差异表达序列的消减文库 ,用差异筛选技术分离差异表达基因。结果 从消减文库中共获得了 9个在正常膀胱组织中高表达、在膀胱癌组织中表达下调的基因 ,分别属于细胞外基质成分和肌动蛋白细胞骨架体系。结论 细胞外基质和肌动蛋白细胞骨架体系中相关基因的表达下调可能反映了肿瘤细胞在细胞粘附、细胞间相互作用、迁移及运动等诸多过程中的异常 ,可能与癌细胞的侵袭和转移密切相关 ,对发展成为膀胱癌的分子标记物具有潜在价值 ;gelsolin。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库 ,克隆HCVNS4B蛋白反式激活相关基因。方法 以HCVNS4B表达质粒pcDNA3 .1( ) NS4B转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,进行抑制性消减杂交分析。将富集的二次PCR产物与T A载体连接 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑取克隆聚合酶链反应 (PCR)扩增后进行测序及同源性分析。结果 文库扩增后得到 3 3个阳性克隆 ,经菌落PCR分析显示其中 2 8个克隆含有大小不等的 2 0 0～ 10 0 0bp插入片段。测序及同源性分析显示 ,12种已知基因编码蛋白 ,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS4B反式激活靶基因。结论 成功构建了HCVNS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,为进一步阐明HCVNS4B反式调节的靶基因在肝炎。

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法:以HCVF蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCVF蛋白反式激活作用的新的靶基因。结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RTPCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCVFTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522。HCVFTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成。结论:HCVF蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌。HCVF反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCVF蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础。