三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库的构建与分析

采用抑制性消减杂交技术构建了三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库。经检验，差异表达基因均被富集了2^10倍左右，证明构建的cDNA消减文库具有很强的消减效率。PCR鉴定发现，在随机挑取的阳性克隆中，95％的克隆均含有0．2～1．0kb的插入片段，这些片段可能是三角帆蚌瘟病病毒感染后差异表达基因的cDNA片段。测序共获得214个有效cDNA序列，分别属于8大类，共98个基因。其中细胞分裂基因2个、细胞结构与运动基因9个、代谢基因10个、信号传导基因7个、细胞防疫基因10个、基因与蛋白表达基因20个、未知功能蛋白基因26个，GenBank中找不到任何同源序列的基因14个。结果说明，构建的差异表达cDNA文库，可较好地反映三角帆蚌瘟病病毒对三角帆蚌影响的基因信息。

小金海棠抑制性消减cDNA文库的构建及文库质量分析

构建小金海棠抑制性消减文库,为进一步大量筛选、克隆苹果铁高效基因、果树转基因工程奠定基础.试验是在提取水培条件下小金海棠缺铁(ETA-Fe2+,4μmol/L)和正常供铁(EDTA-Fe2+,40μmol/L)的根的总RNA,经过LD-pCR扩增双链cDNA后,利用抑制性消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制性PCR,构建了小金海棠缺铁条件下包含1200个独立克隆的消减cDNA文库.用菌落PCR检测,结果显示插入片段大小范围在300～800bp之间,提取质粒进行PCR和质粒RsaⅠ酶切同样也得到一致性的结果.

重症肌无力患者胸腺组织抑制性消减cDNA文库的构建及分析

目的:构建重症肌无力(MG)患者胸腺组织抑制性消减cDNA文库,分析MG胸腺差异表达基因。方法:分别从6例正常和6例MG患者胸腺组织中分离出mRNA,逆转录合成cDNA,行抑制性消减杂交,将得到的差异表达基因进行T-A克隆,构建cDNA文库,并进行序列分析。应用实时荧光定量PCR检测20例MG患者、10例正常对照胸腺组织中GSTM3和KPNA5 mRNA的表达。结果:共获得125个阳性克隆;Blast同源性检索共得到27个差异表达基因;MG患者GSTM3、KPNA5基因表达量(0.671±0.097和0.712±0.080)高于正常对照胸腺(0.582±0.047和0.571±0.018),差异有统计学意义(tGSTM3=5.458,P<0.001;tKPNA5=2.755,P=0.010),与消减文库结果一致。结论:成功建立了MG胸腺组织抑制性消减cDNA文库。

抑制性消减杂交构建奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库

以经产荷斯坦奶牛外周血白细胞为材料,分离Poly(A)+ RNA,反转录合成单链及双链cDNA,经酶切成平均大小为400～600 bp的片段,将患乳房炎奶牛cDNA分成2组,分别与2种不同的接头连接,再与健康奶牛cDNA进行2次消减杂交和2次抑制性PCR扩增,将第2次PCR产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞进行文库扩增,构建了具有高消减效率的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库.文库扩增后得到610个白色阳性克隆,随机挑选克隆进行PCR鉴定,插入片段主要分布在250～750 bp 之间.文库的成功构建为进一步筛选、克隆与奶牛乳房炎抗性相关的基因奠定了基础,对研究奶牛乳房炎抗性的分子机制以及乳房炎的综合防制具有重要意义.

应用抑制性消减杂交技术构建人肝癌组织特异表达cDNA文库

为克隆和筛选肝癌特异表达基因.应用抑制消减杂交技术对肝癌及癌旁组织进行消减杂交,产物PCR扩增后,进行克隆.共得到1820个克隆,1776个克隆有100～800 bp的插入片断,阳性率达98%,说明人肝癌组织特异表达cDNA消减文库构建成功,同时我们对cDNA克隆进行测序,证明这些克隆的功能是和肝癌的发生高度相关的.抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法.

抑制性消减杂交构建肺腺癌及同源正常组织cDNA文库

目的:分离肺腺癌及同源正常组织中的未知特异性基因片段,并建立相应的cDNA文库,为研究肿瘤基因疫苗打下良好的基础。方法:从肺腺癌及同源正常组织中分别提取总RNA,磁珠分离mRNA并逆转录为dsDNA,经RasI消化酶切将Adaptor-1和Adaptor-2R适配子分别与肺腺癌消化后的cDNA连接(作为tester),再与正常同源组织(作为driver)进行正向杂交和逆向杂交。具有上述2种不同适配子的杂交后cDNA分子,通过初次PCR和巢式PCR富集未知的cDNA片段,此PCR产物与TA克隆载体pGEM连接,转化Top10大肠杆菌,获得白色菌落并经菌液PCR扩增出未知基因片段。结果:经正向抑制性消减杂交和逆向抑制性消减杂交分别获取了肺腺癌组织及同源正常组织的特异性cDNA文库。结论:抑制性消减杂交是一种快速、方便、有效的建立cDNA文库的方法。

抑制性消减杂交构建乙型肝炎病毒X蛋白羧基端缺失40个氨基酸cDNA文库

目的：应用抑制性消减杂交（SSH）技术筛选乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白羧基端缺失40个氨基酸（HBx3＇-40）反式激活基因,克隆其反式激活的相关靶基因.方法：以HBx3＇-40蛋白表达质粒pcDNA3（-）-HBx3＇-40 转染Huh-7细胞,以转染pcDNA3（-）-HBx为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取总RNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与pUCm-T载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌JM109进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果：成功构建了HBx3＇-40反式激活基因差异表达的cDNA文库,文库扩增后得到154个白色克隆,经菌落PCR分析,克隆包含有200～800 bp的插入片段,部分片段编码蛋白涉及原癌基因、信号转导相关基因、细胞生长因子相关基因、细胞凋亡、代谢和蛋白合成等相关基因.结论：应用抑制性消减杂交技术成功构建了HBx和HBx3＇-40差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HBx3＇-40在HBV感染相关的肝细胞癌发生中的分子生物学机制提供理论依据.

应用抑制消减杂交技术构建肝癌差异表达基因消减cDNA文库

目的 构建肝癌及癌旁肝组织差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交方法 ,以肝癌组织及癌旁肝组织作为对比材料 ,分离肝癌组织中差异表达基因的cDNA片段 ,将其与T载体进行T/A连接构建文库 ,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩增后 ,随机挑取 1 0 0个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得 30 0 0余个白色阳性克隆 ,随机挑取 1 0 0个白色克隆用PCR进行扩增 ,95%的克隆中均有 1 0 0～ 6 0 0bp的插入片段 ,这些片段可能是肝癌差异表达基因的cDNA片段。结论 用SSH法及T/A克隆技术成功构建了肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库 ,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆肝癌差异表达的新基因奠定了基础。

甘蓝型油菜矮化突变体抑制消减cDNA文库的构建及初步分析

采用抑制性消减杂交（suppressionsubtraetivehybridization，SSH）技术，以甘蓝型油菜矮化突变体“NDF—1”为实验方（tester），野生型“3529”为驱动方（driver）构建植株差异表达的抑制消减cDNA文库。所建eDNA文库的插入片段大小主要集中在100-1000bp之间。斑点杂交筛选得到了32个阳性克隆，序列测定和同源性对比分析表明，其中的12个克隆功能未知，其余涉及到激素信号转导、第二信使、光合作用、脂肪酸代谢及衰老等多个方面。还对部分差异表达基因的功能进行了分析。为进一步认识油菜植株矮化的机理奠定了基础。

海蓬子盐胁迫初期抑制消减杂交cDNA文库的构建

为提高缩叶肉质盐生植物海蓬子总RNA和mRNA的质量，将改良CTAB法与Tripure试剂盒方法相结合，从300mg海蓬子发芽后20d的幼苗中成功分离和纯化了高纯度的总RNA和mRNA。并以无NaCl处理为Driver，以200mmol／LNaCl处理24h、48h、72h的幼苗为Tester，通过cDNA双链的合成及两次PCR扩增，富集到两组处理中差异表达的大小在200～1300bp的cDNA序列，pGEM-T的连接和蓝白斑筛选表明杂交文库滴度和重组率分别达到2，6×10^7和96％，共收集阳性克隆12000个，形成了抑制消减杂交的质粒cDNA文库。随机挑取酶切质粒的电泳分析表明，载体中均有插入片段。两种RNA提取方法的结合有效提高了多汁多色素海蓬子RNA的质量，高效抑制消减杂交文库的建立为进一步分析基因的差异表达及分离抗盐基因奠定了基础。

梨小食心虫滞育与非滞育幼虫抑制性消减文库的构建与分析

【目的】分离和鉴定梨小食心虫(Grapholita molesta(Busck))滞育相关基因。【方法】分别以梨小食心虫滞育和非滞育幼虫为材料,通过抑制性消减杂交技术(SSH),构建梨小食心虫滞育与非滞育正、反向差减cDNA文库,从中筛选梨小食心虫滞育相关基因,并对其进行测序和分析。【结果】在获得的128个滞育特异和132个非滞育特异的EST中,有滞育差异表达EST 42条(17条功能未知)、非滞育差异表达EST 46条(22条功能未知)。对差异表达EST同源检索后推测,其功能大部分与滞育或非滞育特性相关。在滞育个体中,代谢酶和滞育关联蛋白基因表达量较高;在非滞育个体中,贮存蛋白和信号传递基因表达量较高。【结论】这些EST基本反映了梨小食心虫在滞育与非滞育期间的基因表达谱,为今后深入研究梨小食心虫滞育的分子机理奠定了基础。

猪蛔虫感染期幼虫抑制消减cDNA文库的构建

为筛选与线虫感染性相关的基因,本研究以猪蛔虫为对象,构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库,为研究线虫期特异性发育的分子机制奠定基础。分别提取感染期幼虫和其它各期幼虫及成虫的总RNA,纯化mRNA后,采用Clontech公司PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交(SSH),构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库,并采用Southern斑点杂交进行消减效率的检测。随机从文库中抽取45个克隆进行测序及在线BLAST分析。试验结果表明,感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库具有较强的特异性;在得到的41个表达序列标签(ESTs)中,有40个ESTs与已报道的基因有较高的相似性,主要代表猪蛔虫第三期幼虫基因和成虫头部基因,有1个cDNA片段可能代表新基因。猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究幼虫发育差异表达基因的功能奠定了基础。

刚地弓形虫强弱毒株速殖子抑制消减cDNA文库的构建和初步分析

为筛选刚地弓形虫的毒力相关基因,以弓形虫为研究对象,构建了弓形虫强弱毒株抑制消减cDNA文库。分别收集弓形虫Ⅰ型RH株和Ⅱ型QHO株速殖子,提取总RNA,纯化后获得mRNA,并反转录为cDNA。用抑制消减杂交技术(SSH)构建弓形虫强弱毒株正向消减(弱毒株消减强毒株)及反向消减(强毒株消减弱毒株)cDNA文库。从两文库中各筛选10个阳性克隆测序及进行在线BLAST分析。结果显示,构建的弓形虫强弱毒株的消减cDNA文库具有较强的特异性;在获得的18个有效表达序列标签中,有12个与已报道的基因有较高相似性,另外6个可能代表新基因。表明,弓形虫强弱毒株差异表达消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究弓形虫毒力相关基因的功能奠定了基础。

牦牛外周血单个核细胞抑制消减cDNA文库的构建及部分差异表达分子的克隆分析

为筛选牦牛外周血单核细胞(PBMC)差异性基因,以刀豆素A(ConA)和脂多糖(LPS)联合刺激的PBMC cDNA为实验组,未经诱导刺激的PBMC cDNA为驱动组,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了丝裂原诱导刺激PBMC的消减文库并对其部分阳性克隆进行了EST序列分析。从消减文库中随机挑取16个阳性克隆,进行PCR鉴定,显示克隆的重组率大于93%,插入片段大小大部分集中在200bp～1000bp之间。随机挑取100个克隆进行测序及同源性分析,初步获得27条差异表达基因片段,其中24个为已知基因,3个为新ESTs序列;随机选择非重复的6个差异表达的序列设计引物,以半定量PCR方法验证其消减效率。结果显示,均从构建的消减文库中扩增到目的片段,其中5个为诱导性差异表达分子,1个为诱导特异性表达分子,说明该文库有较高的质量。本研究应用抑制消减杂交技术构建了牦牛PBMC的差异表达cDNA文库,并高通量克隆鉴定了相关功能基因片段,表明该技术手段有助于快速发现牦牛新功能基因。

三唑磷作用下翡翠贻贝抑制性消减杂交文库构建与分析

采用抑制性差减杂交技术,构建了三唑磷农药急性胁迫下翡翠贻贝雌贝性腺正反向消减杂交c DNA文库.正反向文库共有117个表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)与NCBI数据库中已知功能蛋白具较高同源性,假定蛋白12种,另有195个ESTs未检索到同源序列.正向文库中含有细胞周期蛋白、性激素合成蛋白、DNA修复蛋白、能量代谢相关蛋白等一系列与生殖、应激适应和代谢相关的转录本信息,而反向文库中的差异ESTs主要涉及DNA复制、转录和翻译调控基因以及骨架蛋白.结果表明三唑磷对翡翠贻贝的毒性涉及到生殖调控、能量代谢、应激适应、转录翻译调控等生理代谢的多个方面,正向文库中发现的几种生殖调控基因(细胞周期蛋白、周期蛋白依赖性蛋白激酶、合子DNA复制许可因子、精子特异性蛋白、雌激素硫酸转移酶和卵黄膜卵透明带域蛋白)可能是三唑磷生殖干扰毒性作用过程中的关键基因,这为有机磷农药的生殖毒性探索提供了基础数据.

白桦雌花序抑制性消减文库构建及EST分析

为研究白桦雌花序发育过程中特异基因的表达,以白桦雌花序样品为tester,雄花序样品为driver,利用SMART策略构建了白桦雌花序抑制性消减(SSH)文库。构建SSH文库的重组率为72%,插入片段的平均长度为400 bp左右。随机挑选文库克隆测序,获得150条EST序列,这些序列被GenBank的dbEST数据库收录,收录号为EE284580-EE284681,EE595316-EE595363。通过BlastX对EST进行功能注释,并对其中同源性较高的111条EST按功能进行分类,EST功能涉及了代谢、细胞防御、转录调节、能量代谢及信号传导等途径。发现了多个已知的控制花发育相关的EST,它们占已知功能EST的21%其功能涉及到调控花序形成和花分化、调控花粉与柱头亲和性以及调控花粉管发育等,包括MADS-box、S-locus F-box等基因。这些EST的获得为了解白桦花期基因表达,白桦花发育相关基因克隆和功能解析奠定了基础。

nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株抑制消减cDNA文库的构建

背景与目的已有的研究表明,nm23-H1基因是一个重要的肺癌转移抑制基因,为了筛选与该基因表达相关的差异表达基因,本研究拟构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆与nm23-H1转移相关的基因奠定基础。方法利用抑制消减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)技术构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)间差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库,经蓝白菌落筛选克隆,并PCR反应鉴定。结果成功构建了该两株细胞株差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库。经蓝白菌落筛选,正向消减文库总共获得约300个白斑克隆,反向消减文库总共获得约400个白斑克隆,从正反向消减文库中各挑选96个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示在挑选的正向文库中有84个克隆有插入片段,反向文库中有83个克隆有插入片段,其片段大小范围为(300-750)bp。结论抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,我们应用SSH法和T/A克隆技术成功建立了nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库。nm23-H1基因在肺癌细胞中的表达可能影响某些转移相关基因的差异表达。

长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库的构建与分析

为构建长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库,获得长角血蜱雄性成蜱在半饱血状态下的特异表达基因,用抑制消减杂交方法构建以pGEM-T Easy为载体的长角血蜱半饱血雄蜱全蜱cDNA文库,测序并进行生物信息学分析。以新合成的长角血蜱饥饿和半饱血雄蜱cDNA第一链为模板,用RT-PCR方法对从文库中挑选的5个表达序列标签(EST)进行鉴定。初步获得18个EST,BlastX分析显示,所得cDNA编码的功能性蛋白主要包括信号传导、组织形态形成、转录调节和糖类代谢等相关蛋白。RT-PCR鉴定结果显示,随机挑选的5个新EST中有3个在半饱血状态下差异表达。结果表明,成功地构建了长角血蜱雄性全蜱抑制消减杂交文库,获得了有潜在生物学功能的EST。

运用抑制性消减杂交技术构建糖尿病肾阳虚证DNA消减文库

目的:运用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建糖尿病(Diabetic mellitus,DM)肾阳虚证DNA消减文库。方法:选择汉族中医辨证为肾阳虚证的DM患者以及正常人做对照组,进行正向和反向消减杂交。用RsaⅠ酶切用硅胶法抽提基因组DNA成大小不等的片段,分别连接两种不同的接头,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U/A载体连接,经蓝白斑筛选及菌液PCR筛选出阳性重组质粒,构建DM肾阳虚证DNA消减文库。结果:用SSH方法筛选出DM肾阳虚证的差异DNA片段,经克隆及PCR筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了DM肾阳虚证的DNA消减文库。结论:SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建DM肾阳虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆DM肾阳虚证相关基因奠定了基础。

快速老化模型小鼠海马正反向抑制消减cDNA文库的构建

目的:构建快速老化模型小鼠(SAM)海马正反向抑制消减cDNA文库,以揭示SAMP8学习记忆脑老化的机制,同时为研究阿尔茨海默病(AD)的发病机制提供线索。方法:以快速老化模型小鼠SAMP8和SAMR1海马的总RNA为材料,采用抑制消减杂交方法和蓝白斑筛选克隆构建文库,并用PCR鉴定了文库的质量。结果:成功构建了12月龄雄性SAMP8和SAMR1海马的正反向抑制消减cDNA文库,其中正向文库包含864个克隆,反向文库包含960个克隆,阳性克隆率为96.16%,插入片段范围为250～2000bp。结论:SAMP8和SAMR1海马的正反向抑制消减cDNA文库的构建,为进一步筛选鉴定SAMR1和SAMP8海马差异表达基因提供了丰富的实验材料。