抑制性谷氨酸门控氯离子通道的研究进展

作为半胱氨酸环配体门控离子通道中的一员,抑制性谷氨酸门控氯离子通道(IGluCl)的亚基及其装配具有多样性,从而导致其药理性质的不同。通道对某种化合物的选择性结合与通道中存在的一些关键位点的氨基酸残基有关。通道mRNA的转录后修饰作用是通道亚型及其功能多样化的原因。有关通道门控及离子选择机制的研究为新药及杀虫剂的开发和筛选奠定了基础。从药理性质、通道中影响药物结合特性的残基位点、通道基因的转录后修饰作用以及配体门控离子通道的门控机制等方面综述了IGluCl通道的研究情况。

黄曲条跳甲谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)基因序列特征及表达分析

氯离子通道与农业害虫的抗药性发生有密切关联。本研究结合转录组测序及荧光定量PCR技术,鉴定和分析黄曲条跳甲Phyllotreta striolata(Fabricius)谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)的基因序列特征、功能及基因表达谱。结果表明:本研究所获得的GluCl cDNA序列长度为1430bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)长为1344bp,编码447个氨基酸残基。其推测蛋白分子主要含神经递质分子胞外结合域和胞内跨膜域两大功能域,其亲水的胞外结合域又含有2个由半胱氨酸二硫键形成的氨基酸残基桥环,表现出GluClα亚基的典型特征。cDNA序列的系统发育分析表明,该GluCl与其他昆虫的GluClα高度同源,而在脊椎动物中则与γ-GABA或甘氨酸配体门控氯离子通道同源。荧光定量PCR分析表明,该GluCl基因在黄曲条跳甲雌雄成虫的不同部位中都有表达,但是在头部的表达量非常高,如雄虫头部的表达量是其精巢的65.7倍、是其中肠的227.5倍,揭示GluCl基因在中枢神经组织中具有重要作用。本研究为进一步研究GluCl介导的黄曲条跳甲抗药性的发生及其分子机理奠定了基础。

耐伊维菌素捻转血矛线虫谷氨酸门控氯离子通道gbr-2基因分析

为了解谷氨酸门控氯离子通道（Glucl）gbr-2基因在捻转血矛线虫抗伊维菌素虫株是否存在突变,以及变异情况如何,本试验以捻转血矛线虫耐伊维菌素虫株作研究对象,提取基因组DNA后以特异性引物扩增gbr-2基因,并对扩增产物进行测序和分析.同时以敏感株虫体作对照.试验结果表明,与对照组相比,耐药株的基因序列发生了突变,在80～170 bp处出现多处突变;在192～207 bp处的碱基发生丢失.两者同源性为88.9％.试验结果说明,捻转血矛线虫抗伊维菌素虫株的谷氨酸门控氯离子通道gbr-2基因确实存在突变,为进一步了解捻转血矛线虫抗伊维菌素虫株的耐药性分子机制,以及筛选耐药性检测的分子标记,建立耐药性的早期检测手段提供重要数据.

朱砂叶螨谷氨酸门控氯离子通道GluCl1基因的克隆与序列特征分析

朱砂叶螨是一种分布广泛、危害极大、难以防治和易产生抗性的农业害螨。为了研究朱砂叶螨杀螨剂神经靶标谷氨酸门控氯离子通道,进一步确定阿维菌素对朱砂叶螨的抗性机理,采用同源基因克隆以及RACE技术,克隆朱砂叶螨杀螨剂靶标谷氨酸门控氯离子通道(GluCl1)基因全长,分析其序列特征。结果表明,GluCl1基因序列全长为1856bp,其中开放阅读框(ORF)为1338bp,编码455个氨基酸,N端含25个氨基酸的信号肽,有4个跨膜结构域,GenBank登陆号为KC543353。同源比对分析表明,朱砂叶螨与其他蜱螨目GluCl基因有高度的同源性,特别与二斑叶螨的相似度最高。研究还发现朱砂叶螨敏感品系GluCl1第3个跨膜区的G314,与二斑叶螨敏感品系相应位点的氨基酸G323一致,而二斑叶螨抗性品系相应位点突变为D323。本研究进一步证实了G323突变为D323和二斑叶螨对阿维菌素产生抗性有关。本研究为今后建立以朱砂叶螨谷氨酸门控氯离子通道为靶点的选择性杀螨剂体外筛选体系奠定坚实基础。

昆虫谷氨酸门控氯离子通道研究进展

谷氨酸门控氯离子通道(GluCls)介导快速抑制性神经传导,目前只发现于无脊椎动物中,是开发新型杀虫剂的理想作用靶标。GluCls属于半胱氨酸环超家族的配体门控离子通道,在昆虫中只发现有1个α亚基,但可以通过选择性剪接生成多种亚基剪接变体并且能够形成功能性受体。除了典型的神经传导功能外,GluCls还参与调控昆虫保幼激素合成及生长发育等生理功能。GluCls的氨基酸突变和表达量变化是导致昆虫对杀虫剂产生抗药性的部分原因。本文主要从GluCls的分子特征、选择性剪接、药理学性质、生理功能和昆虫的抗药性5个方面对昆虫GluCls的研究进展作一综述,为新型杀虫剂的研发提供理论基础。

国家自然科学基金面上项目《高选择性谷氨酸门控氯离子通道筛选体系研究与应用》通过验收

由向文胜为项目主持人的国家自然科学基金面上项目《高选择性谷氨酸门控氯离子通道筛选体系研究与应用》通过验收。获得安全，环境友好的新农药化合物，是新农药创制的迫切任务，而建立对靶生物与人畜、鱼鸟等高选择性筛选体系，是创制绿色农药的重要基础。

苹果园二斑叶螨对常用杀螨剂的抗性水平及抗性基因突变频率检测

二斑叶螨是苹果主要农业害螨,每年造成经济损失严重。采用药管浸叶法测定了陕西礼泉、山西运城和云南石林种群对3种常用杀螨剂的抗性水平,采用特异性等位基因PCR(PASA)技术检测了2年田间种群对阿维菌素的抗性基因突变频率。结果表明,3种杀螨剂的杀螨活性由高到低依次为阿维菌素>乙唑螨腈>联苯肼酯,田间种群对阿维菌素的抗性倍数最高。2019年,二斑叶螨运城、礼泉和石林种群Glu Cl抗性基因突变频率分别为98.94%、97.78%和1.09%;2022年,3个种群Glu Cl抗性基因突变频率分别为100.00%、98.91%和1.06%。秦晋地区二斑叶螨田间种群对阿维菌素抗性风险较高,因此田间防治二斑叶螨应该轮换使用阿维菌素,同时进一步加强田间抗性监测工作。

小菜蛾GluCl受体α亚基cDNA基因克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术对小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]4龄幼虫谷氨酸门控的氯离子通道(GluCl)受体cDNA全长进行了克隆和序列分析。通过设计简并性上、下游引物扩增出小菜蛾GluCl受体α亚基基因192bp的cDNA片段,根据得到的片段序列设计3′和5′特异性引物采用RACE技术进行3′和5′末端的克隆,获得了小菜蛾GluCl受体的cDNA的完整序列,GenBank登录号为GQ221939。该基因全长2144bp,其开放阅读框(ORF)1344bp,编码447个氨基酸。相似性分析表明:它与果蝇和赤拟谷盗的相似性均为73%,与埃及伊蚊的相似性为75%,与东亚飞蝗的相似性为79%;氨基酸分析后显示它具有GluClα亚基的典型特征,表明克隆的cDNA序列是小菜蛾GluClα亚基基因的序列。

小菜蛾GluClR同源模建及与阿维菌素类化合物的对接

阿维菌素类生物杀虫剂作用于谷氨酸门控氯离子通道受体(Glu Cl R),该受体是杀虫剂的重要作用标靶之一,对其深入研究,可以开发新型杀虫剂。为研究阿维菌素类杀虫剂的作用机理,开发更高效、安全的阿维菌素衍生物。本研究以实验解析得到的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)Glu Cl三维结构为模板(PDB:3RHW),同源模建了小菜蛾(Plutella xylostella)Glu Cl受体三维结构,将模建的小菜蛾Glu Cl受体分别与阿维菌素(AVM)、伊维菌素(IVM)及埃玛菌素(EMA)进行分子对接。结果表明,这三个化合物对接模式相近,主要是糖环部分嵌入受体M1与M2亚基之间,埃玛菌素与小菜蛾Glu Cl受体对接打分明显优于伊维菌素和阿维菌素。本研究结果对阿维菌素的进一步衍生化具有理论指导意义。

甘氨酸受体的研究进展

甘氨酸受体 (GlyR)是中枢神经系统中一种重要的抑制性受体 .GlyR是氯离子 (Cl-)选择性通道蛋白 ,属于配体门控离子通道超家族的一员 .天然GlyR是由α和β亚基组装而成的五聚体 .介绍了近年来有关GlyR的结构、功能、药理特性研究的重要进展 ,并结合本实验室工作 。

甜菜夜蛾SeGluCl剪接变异体的敲除及其对杀虫剂敏感性的影响

【目的】本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,探索甜菜夜蛾Spodoptera exigua谷氨酸门控氯离子通道(glutamate-gated chloride channels,GluCls)基因不同转录变异体编码的SeGluCls对杀虫剂敏感性是否存在差异。【方法】采用RT-PCR和RACE技术获得甜菜夜蛾SeGluCl的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除SeGluCl两个剪接变异体SeGluCl 3a和SeGluCl 3b,并构建甜菜夜蛾敲除品系(3a-KO和3b-KO),生物测定甜菜夜蛾敏感品系WH-S(对照品系)及3a-KO和3b-KO品系的3龄幼虫对阿维菌素、甲维盐和氟虫腈3种杀虫剂敏感性的差异。【结果】获得了甜菜夜蛾SeGluCl全长cDNA序列,并发现其2种剪接变异体(SeGluCl 3a和SeGluCl 3b),SeGluCl 3a(GenBank登录号:OM304353)的开放阅读框(open reading frame,ORF)长1362 bp,编码454个氨基酸,SeGluCl 3b(GenBank登录号:OM304354)的ORF长1365 bp,编码455个氨基酸。两种剪接变异体SeGluCl 3a和SeGluCl 3b编码的SeGluCls都包含4个跨膜区和1个半胱氨酸环。系统发育分析表明,SeGluCl与斜纹夜蛾S.litura和草地贪夜蛾S.frugiperda的GluCl亲缘关系最近。与对照品系WH-S相比,3a-KO和3b-KO敲除品系对阿维菌素、甲维盐和氟虫腈的敏感性无显著差异。【结论】甜菜夜蛾SeGluCl剪接变异体SeGluCl 3a和SeGluCl 3b编码的SeGluCls对阿维菌素、甲维盐和氟虫腈这3种杀虫剂的敏感性无差异。

Ⅰ型代谢型谷氨酸受体与癫癎

在哺乳动物的中枢神经系统中,谷氨酸是调节绝大多数神经突触兴奋性的主要神经递质.这种调节作用主要是通过激活以下受体来实现的,配基门控离子通道型谷氨酸受体(iglur,简称离子通道型谷氨酸受体)和代谢调节型谷氨酸受体(mglur,简称代谢型谷氨酸受体).

二斑叶螨对阿维菌素的抗药性及抗性基因的PASA检测技术

为了明确二斑叶螨Tetranychus urticae Koch对阿维菌素的抗性水平,采用玻片浸渍法测定了北京4个地区二斑叶螨雌成螨对阿维菌素的抗药性,建立了特异性等位基因PCR(PASA)方法,并检测了二斑叶螨谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)基因片段上G323D的突变频率。结果显示,北京昌平、海淀、密云和怀柔4个田间二斑叶螨种群对阿维菌素均达极高抗性水平,其中昌平种群抗性最高,LC50值为448.93 mg/L,抗性倍数为4988.11倍。室内敏感种群未见抗性个体,昌平和密云种群G323D等位基因突变频率为100.00%,怀柔和海淀种群分别为86.25%和90.00%。北京4个地区二斑叶螨种群对阿维菌素达极高抗性水平,抗性基因的突变频率也很高,表明阿维菌素不适宜用来防治这些地区的二斑叶螨种群。

二斑叶螨对阿维菌素抗性的CAPS标记

为了实现二斑叶螨Tetranychus urticae Koch对阿维菌素抗药性的快速检测,本研究建立了一种叶螨对阿维菌素抗药性的快速分子检测技术,即酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS)标记技术,检测二斑叶螨谷氨酸门控氯离子通道(Glu Cl3)基因片段上G326E的突变频率,并采用琼脂浸叶法测定田间5个种群对阿维菌素的抗药性。结果表明,北京密云、顺义、昌平、浙江宁波和海南吉阳5个种群对阿维菌素的抗性倍数分别达1 155.63、1 317.10、844.19、314.95和1 799.69倍,均为极高抗性水平;CAPS检测发现我国二斑叶螨抗性基因存在G326E位点突变,但在供试的5个不同种群中突变频率变异很大,其中北京昌平种群G326E突变频率高达90.00%,密云和顺义种群均为26.67%,浙江宁波种群为5.00%,而海南吉阳种群不存在该位点的突变。表明该CAPS标记还需与其它抗性机制或检测技术结合来实现叶螨对阿维菌素抗性的早期检测和预警。

二斑叶螨GluCl的同源模建及与阿维菌素类杀虫剂的分子对接

谷氨酸门控氯离子通道受体目前仅发现存在于无脊椎动物的神经系统中,是理想的杀虫剂标靶之一。阿维菌素因其高效、低毒、高选择性的特点是目前全球使用范围最广的生物杀虫剂。为研究阿维菌素类杀虫剂的作用机理,开发更高效的阿维菌素类杀虫剂,以秀丽隐杆线虫的谷氨酸门控氯离子通道为模板,同源模建了二斑叶螨氯离子通道并与埃玛菌素、伊维菌素和阿维菌素进行分子对接,发现埃玛菌素与二斑叶螨氯离子通道对接结果明显优于伊维菌素和阿维菌素。