HCVIRES特异性抑制性RNA二级结构模拟及自剪切转录载体构建

目的 :构建可保证HCVIRES特异性抑制性RNA(IRNA)序列完整性的转录载体。 方法 :应用计算机软件模拟IRNA二级结构 ;体外化学合成IRNA及其互补体的cDNA ,以AatⅡ和XbaⅠ双酶切后克隆入具自剪切作用的顺式核酶载体pGEMRz中 ;应用酶切方法、PCR和测序法对重组载体进行三重鉴定 ;最后对重组体进行体外转录。 结果 :计算机模拟发现HCVIRES特异性IRNA二级结构包括两个环、一个茎状结构和一个膨出 ,在其序列两端加3～ 5个碱基不会改变其二级结构 ,而缺失 3～ 5个碱基却会明显改变其结构。经三重鉴定证实 ,目的序列被正确地克隆入质粒pGEMRz,并经体外转录得到约 70个碱基大小的IRNA。 结论 :本研究构建转录载体pGRz IRNA可保证IRNA序列的完整性。

IRES特异性抑制性RNA对HCV IRES介导的蛋白翻译的体外抑制作用

目的 研究IRES特异性抑制性RNA(IRNA)对HCVIRES介导蛋白翻译的体外抑制作用。方法 体外化学合成IRNA及其互补体RNA(cIRNA)的cDNA ,以AatⅡ和XbaⅠ双酶切后克隆入具有自剪切作用的顺式核酶载体pGEMRz中 ;最后对重组体的体外转录体在体外无细胞反应体系中的抑制活性进行了初步探讨。结果 IRNA和cIRNA在体外无细胞翻译体系中对HCVIRES介导的蛋白翻译具有相似的抑制活性 ,最大抑制率达 90 %左右。结论 IRNA及cIRNA在体外对HCVIRES介导的蛋白翻译均具有抑制活性。

HCV IRES特异性抑制性RNA结构模拟及在体外对病毒翻译启动的抑制作用

目的计算机模拟IRNA二级结构,研究HCV IRES特异性抑制性RNA对HCV IRES介导蛋白翻译的体外抑制作用。方法应用计算机软件模拟IRNA二级结构;体外化学合成IRNA及其互补体的cDNA,以Aat Ⅱ和Xba Ⅰ双酶切后克隆入具有自剪切作用的顺式核酸载体pGEMRz中;应用酶切方法、PCR方法和测序法对重组载体进行三重鉴定。最后应用含HCV IRES的双顺反子构建体pT7DC1-341和单顺反子构建体pCMVNCR1uc对重组体的体外转录体RNA及其互补体IRNA(cIRNA)在体外无细胞反应体系中的抑制活性进行了初步研究。结果计算机模拟发现HCV IRES特异性IRNA二级结构包括2个环、1个茎和1个大的膨出,cIRNA具有相似的结构;在IRNA一级序列两端加3～5个碱基不会改变其二级结构,而缺失3～5个碱基却会明显改变其结构。IRNA和cIRNA在体外无细胞翻译体系中对HCV IRES介导蛋白翻译具有相似的抑制活性。结论本研究构建转录载体pGRz-IRNA可保证IR-NA结构正确性,IRNA及cIRNA在体外对HCV IRES介导蛋白翻译具有相似的抑制活性。

抑制性RNA的抗HCV作用

丙型肝炎基因治疗是目前研究热点。主要策略包括反义核酸策略、核酶策略、细胞内干扰性多肽或蛋白策略、抑制性RNA等,本文仅就抑制性RNA研究进展作了综述。

抑制性RNA在细胞内对丙型肝炎病毒5′非编码区翻译启动的抑制作用

目的 研究核糖体内部进入位点 (IRES)特异性抑制性RNA(IRNA)在细胞内对HCV 5′非编码区 (NCR)IRES翻译启动功能的抑制作用。方法 通过脂质体介导的基因转染方法 ,转染IRNA真核表达体与带荧光素 (luc)的靶基因真核表达载体于人肝癌细胞 (HHCC) ,应用发光仪检测luc报告基因的表达活性。结果 IRNA能有效地抑制由HCV 5′NCRIRES介导的luc基因表达 ,抑制率最高达90 %,最低 5 0 %,而IRNA突变体 (mIRNA)无此活性。结论 IRES特异性IRNA能有效地抑制HCV 5′NCR介导的蛋白翻译启动作用。

抑制性RNA对细胞内HCV IRES介导HCV核心蛋白表达抑制作用的定量分析

目的 定量观察核糖体内部进入位点 (Internalribosomeentrysite ,IRES)特异性抑制性RNA(inhibitorRNA ,IRNA)对细胞内HCVIRES介导的HCVC基因表达的抑制作用。方法 构建IRES特异性IRNA的真核表达载体 (pcRz IRNA) ,将该质粒与 pcHCVcluc(含HCV 5′非编码区、核心区与荧光素酶基因 )共转染人肝细胞癌 (HHCC)细胞株 ,对转染后 72h细胞表达HCVC抗原进行间接免疫荧光染色 ,用激光共聚焦显微镜对其含量进行定量分析。用荧光素酶检测试剂盒对其活性进行检测。结果 共转染细胞可表达HCVC抗原 ,同对照组相比 ,IRNA组荧光量明显下降。结论 在IRNA与HCV共转染细胞中 ,IRNA对HCVIRES介导蛋白翻译具抑制作用。

转移抑制性长链非编码RNA对肺癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨转移抑制性长链非编码RNA(lncRNA LIMT)对肺癌细胞增殖、凋亡的影响。方法取肺癌A549细胞,分别转染lncRNA LIMT过表达质粒p EGFP-C1-LIMT及其空质粒p EGFP-C1-NC、敲减质粒siRNA-LIMT及其空质粒siRNA-NC,并相应作为p EGFP-C1-LIMT组、pEGFP-C1-NC组、siRNA-LIMT组、siRNA-NC组。分别应用CCK-8增殖、细胞流式试验观察各组细胞增殖凋亡能力,采用RT-q PCR法检测lncRNA LIMT表达,Western boltting法检测各组EGFR-ERK信号通路关键分子蛋白表达水平。结果 p EGFP-C1-LIMT组A549细胞增殖能力低于p EGFPC1-NC组,siRNA-LIMT组A549细胞增殖能力高于siRNA-NC组(P均<0.05)。p EGFP-C1-LIMT组A549细胞凋亡比例高于p EGFP-C1-NC组,siRNA-LIMT组A549细胞凋亡低于siRNA-NC组(P均<0.05)。lncRNA LIMT水平p EGFP-C1-LIMT组高于p EGFP-C1-NC组,siRNA-LIMT组低于siRNA-NC组(P均<0.05)。pEGFP-C1-LIMT组A549细胞EGFR、p-ERK蛋白低于pEGFP-C1-NC组,p-EGFR、ERK蛋白高于p EGFP-C1-NC组(P均<0.05);siRNA-LIMT组A549细胞EGFR、p-ERK蛋白高于siRNA-NC组,p-EGFR、ERK蛋白低于siRNA-NC组(P均<0.05)。结论 lncRNA LIMT可以抑制肺癌细胞的增殖,促进肺癌细胞凋亡,其机制可能与lncRNA LIMT调控EGFG-ERK信号有关。

丙型肝炎新型治疗方法的研究动态

α-干扰素是目前国际上唯一公认治疗丙型肝炎有效的药物,但它的疗效远不能满足临床病人的需要。近年来,白细胞介素-12、乳铁蛋白、抑制性RNA、舒拉明、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、基因疫苗和核酶技术在治疗丙型肝炎中取得了较好的效果,因此可能具有一定的应用前景。