抑制性消减杂交技术(SSH)及其在基因克隆上的应用

简要概述了抑制性消减杂交技术的基本原理、基本过程、优越性。

利用抑制消减杂交技术(SSH)研究与Ty21a免疫相关的基因

目的:利用抑制消减杂交技术（SSH）筛选与Ty21a免疫相关的新基因。方法:以Ty21a免疫小鼠的肠细胞为tester,以正常小鼠的肠细胞为diver,提取mRNA,反转录构建cDNA文库,利用SSH技术筛选Ty21a免疫相关的新基因。结果:通过SSH技术和cDNA微矩阵技术,发现了7条与GenBank中已公布的表达序列标签（expressed sequence tag,EST）片段没有明显同源性,可能为Ty21a免疫相关的新基因。其中3条正在用RACE-PCR法进行获得全长cDNA的工作。结论:SSH技术是一种高效的差异基因筛选方法,基因表达谱芯片技术是高通量进行基因表达模式研究的方法,Ty21a可诱导多种免疫相关新基因的表达。

抑制消减杂交技术(SSH)及其在兽医领域的应用

基因的差异表达是生命活动的核心机制,在不同发育时期和不同生理阶段中不同细胞或同类细胞在表达上不同,这为研究生命活动过程提供重要的信息。抑制消减杂交技术(SSH)是近年来新兴的用于分离差异表达基因的手段之一,此技术结合了消减杂交和抑制性PCR的优点,广泛应用于兽医领域。文章对SSH原理、方法和特点进行了阐述,对其在微生物、动物疾病、动物生育和寄生虫学中的应用做了相应的概括介绍。

几个提高抑制消减杂交(SSH)文库质量的技术改进

抑制消减杂交(SSH)高灵敏、易操作、高效富集低表达丰度基因和均一化目的基因片断,广泛用于差异表达基因的分离和cDNA文库构建。在实验操作中常出现低表达mRNA和cDNA丢失、大片断连接效率低等问题,构建的文库质量差,文章通过改进萃取操作提高目的产物(mRNA和cDNA)回收率,回收率增加30%以上;通过采用PVPP、高浓度KAc专一性结合和LiCl沉淀等措施除去RNA中的多酚和多糖、进而增加可分离mRNA种类和含量,对应的Uni-EST种类增加近3倍,通过采用胶回收并分段连接保护大片断cDNA等措施使文库中转录本丰富度增加,大片段(500 bp以上)比例增大,cDNA平均长度增大,文库质量明显提高。

抑制性消减杂交技术(SSH)及其在烟草生物学研究中的应用

抑制性消减杂交技术(SSH)是基于抑制性PCR及差减杂交技术建立的一种新技术。目前,由于该技术具有速度快、假阳性率低、灵敏程度高等优点,在植物学研究的各个领域得到了广泛的应用。对该技术的原理和方法、主要优缺点及其在烟草研究中的应用进行了综述。

抑制性消减杂交技术(SSH)及其在植物抗病性机制研究中的应用

抑制性差减杂交是建立在抑制PCR及差减杂交技术基础上的,研究未知基因表达的一门技术。该方法具有灵敏性高、操作简单、稳定、可靠等特点,适合于从整体水平研究基因的差异表达。笔者就该技术的原理、发展、优缺点及其在植物抗病性机制研究中的应用进行了综述。

抑制性消减杂交技术(SSH)在辣椒抗病基因研究中的应用

基于抑制性PCR及差减杂交技术建立的抑制性消减杂交技术,因其假阳性率低、敏感性高、效率高等优点广泛应用于植物基因差异表达研究。对该技术的原理、主要优缺点及其在辣椒植物抗病性机制研究中的应用进行了综述。

抑制性消减杂交(SSH)技术及其应用

抑制性消减杂交技术(SSH)是一种高效检测差异表达基因的方法。详细论述了抑制性消减杂交的基本原理及过程,并简要介绍了其在工业生产菌种改良中的应用。

抑制性消减杂交技术(SSH)在动物免疫相关基因方面的研究进展

对于一个生物个体来讲,尽管所有细胞的基因组成是相同的,但在不同的细胞、同一细胞不同的分化阶段或受到外界的不同刺激时,相关基因的表达及蛋白质的功能都会有所差异（[1]）。基因的差异表达是调控生物生命活动的核心机制,个体的生长发育和衰老死亡,以及对各种环境因子的应答,本质上都离不开差异基因的表达。为了阐明各种生命过程的分子机制,必须对差异表达基因进行分离、克隆并进一步研究,抑制性消减杂交（Suppression subtractive hybridization,SSH）应运而生,

抑制性消减杂交(SSH)技术在法医学中的应用前景

抑制性消减杂交(SSH)是以抑制性PCR为基础结合标准化与消减杂交技术、建立的一项筛选与分离未知差异表达基因的新技术,该技术具有快速、简便、灵敏、特异、高效、所需起始样本量较少等特点,已广泛应用于疾病的病因病理、损伤机制及损伤反应与修复等领域的分子生物学研究,本文总结SSH的研究进展并探讨其在法医学中的应用前景。

抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中的应用

用抑制性消减杂交技术（SSH）研究与鲤鱼（Cyprinus carpio）抗寒性状相关的基因。通过对荷包红鲤抗寒品系（Cyprinus carpio wuyanensis Tchang）和柏氏鲤（Cyprinus pellegnini Tchang）杂交F2代进行降温诱导实验，获得不同温度下的实验材料。利用抑制消减杂交技术构建了一个低温下差异表达基因的消减cDNA文库，共含有2000个克降。对其叶1480个克隆进行斑点杂交筛选，共得到60个阳性克隆，选取其中29个克隆测序。通过序列分析比对，13个克隆与已知基因序列高度同源，同源性为85％-98％；另外的13个克隆为未知新基因序列。在13个同源性较高的克隆序列巾，有brevican基因、AMP—acid连接酶、CFL2基因、催产素基因、主要组织兼容复合体（MHC）Ⅱβ链、锌指蛋白、细胞色素氧化酶、EPD-1基因、透明质酸结合蛋白多糖类、核受体／类视色素信号调节器等，其中9个基因上调表达，另有4个则抑制表达。这些基因的获得可为研究鱼类抗寒性状以及从分子水平上阐明其机制提供重要依据。

利用抑制消减杂交技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因

为了筛选线虫的性别特异性基因,为线虫乃至寄生虫的性别控制提供新的工具,本研究选择猪蛔虫(Ascarissuum)为模型,分别提取雌性和雄性成虫的mRNA后,采用Clontech公司的PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交(SSH),构建猪蛔虫雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库,并采用地高辛(DIG)标记的cDNA探针进行Southern杂交检验所构建文库的消减效率。结果表明,雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库均具有很强的性别特异性。随机从各库中各抽取25个克隆进行测序及在线BLAST分析,发现在25个雄虫ESTs中有20个已知ESTs,5个新的ESTs;25个雌虫ESTs中有11个已知ESTs,还有8个可能为新基因。猪蛔虫性别差异表达的消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究性别特异基因的功能奠定了基础。

应用抑制消减杂交技术构建肝癌差异表达基因消减cDNA文库

目的 构建肝癌及癌旁肝组织差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交方法 ,以肝癌组织及癌旁肝组织作为对比材料 ,分离肝癌组织中差异表达基因的cDNA片段 ,将其与T载体进行T/A连接构建文库 ,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩增后 ,随机挑取 1 0 0个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得 30 0 0余个白色阳性克隆 ,随机挑取 1 0 0个白色克隆用PCR进行扩增 ,95%的克隆中均有 1 0 0～ 6 0 0bp的插入片段 ,这些片段可能是肝癌差异表达基因的cDNA片段。结论 用SSH法及T/A克隆技术成功构建了肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库 ,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆肝癌差异表达的新基因奠定了基础。

抑制差减杂交(SSH)技术及其在植物基因分离上的应用

SSH是一种基于抑制PCR和差减杂交技术建立的 ,在转录水平上研究基因表达的技术 ,具有稳定、高效、可靠的特点 ,可对生物的生长、发育、衰老、死亡等生命过程及生物或非生物逆境胁迫对生物所造成的影响等进行全面、系统的分析。简单介绍了SSH的基本原理、技术要点 。

应用抑制消减杂交(SSH)克隆肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因

目的 克隆和筛选肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因。方法 将肺腺癌多药耐药细胞 (SPC A 1/CDDP)作为实验组 ,肺腺癌细胞 (SPC A 1)作为对照组 ,应用抑制消减杂交技术 ,构建实验组特异表达cDNA消减文库 ;用斑点杂交初步筛选cDNA消减文库后 ,将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析 (Genebank)。结果 建立了一个肺腺癌多药耐药细胞 (SPC A 1/CDDP)特异表达cDNA消减文库 ,斑点杂交初步筛选显示 2 3个克隆中有SPC A 1/CDDP特异表达cDNA片断 ,测序和同源性分析表明 2个cDNA片断为新序列 ,其余cDNA片断与已知基因有 96%～ 10 0 %的同源性。结论 2个新的cDNA序列可能为未知肺腺癌多药耐药相关基因序列 ;抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法。

辣椒N基因介导抗根结线虫作用早期表达基因的抑制性消减杂交SSH分析

以含N基因的辣椒(Capsicum annuumL.)为试验材料,接种南方根结线虫(Meloidogyne in-cognita)12、24、36h的根尖材料作为测验方(tester),相应的未接种根尖材料作为驱动方(driver),构建一个南方根结线虫诱导N基因表达早期的正向抑制消减杂交cDNA文库,并结合文库高密度点阵膜杂交差异筛选,获得了237条表达序列标签(EST)。在GenBank上进行BLASTn与BLASTx分析,得到148条功能已知的EST序列,获得已知的上调抗性相关EST68个。分离出了具有NBS-LRR结构的抗线虫蛋白和类LRR抗性蛋白的基因,防御作用相关的类萌芽素(GLP)、HSR203J蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽等基因,抗性相关的WRKY、ERFBP等转录因子基因,以及G蛋白、14-3-3蛋白等多种信号蛋白基因。通过Gene Ontology分析,N基因介导的早期表达抗病基因涉及病原物的识别、抗性信号传导、过敏性坏死、系统获得性抗性以及植物细胞保护机制等多个方面,并有许多功能未知的基因有待于进一步的研究。

抑制性差减杂交(SSH)技术在分离植物差异表达基因中的应用

抑制性差减杂交技术(SSH)是基于抑制PCR作用的cDNA差减杂交,是在转录水平上研究差异基因表达的技术。该技术在一个循环过程中完成差异表达基因丰度的均等化及目标群体和对照群体中相同基因的去除,从而实现差异表达基因的高度富集。一个典型的SSH过程,可在一个差减杂交过程中将稀有基因序列富集上千倍。本文通过详细分析该技术在植物差异表达基因分离中的应用发现:SSH技术主要用于分离组织特异性表达和诱导型表达的基因。首先,SSH技术广泛应用在分离植物发育过程中不同发育阶段和不同组织器官中的组织特异性表达的基因,为揭示植物生长发育过程的分子机理提供了有效手段;另外,在不同植物中,该技术被大量应用于分离各种生物及非生物胁迫条件下诱导表达的抗性相关基因,可以揭示植物抗逆的分子机理。目前,SSH技术已开始应用于分离与次生代谢产物合成相关的基因。SSH技术是分离植物差异表达基因,揭示植物复杂生命现象分子机理的有效方法,将在植物差异表达基因研究中得到更广泛的应用。

抑制性消减杂交技术原理及应用

0引言 抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA消减杂交技术.通过合成两个不同的接头,连接于测试cDNA片段的5'末端,达到选择性扩增差异性表达的cDNA片段,抑制非目的cDNA的扩增.该技术与其他消减杂交技术相比具有假阳性率低、敏感性高、效率高等优点而得到广泛应用.

利用抑制消减杂交技术筛选鹅就巢行为相关基因

旨在利用抑制消减杂交技术构建鹅就巢与产蛋cDNA基因文库,筛选就巢母鹅上调与下调表达的基因。以就巢期和产蛋期鹅卵巢组织互为检测子和驱动子,进行正反双向消减杂交,获得鹅卵巢差异表达基因文库。从双向文库随机挑选单菌落进行PCR验证,结果表明文库质量良好。选取654个阳性克隆进行测序分析,获得641条表达序列标签(ESTs)。对ESTs进行去除载体序列、质量检测、聚类及拼接,经BLASTn比对,有166条ESTs找到与之匹配的同源序列,其中92个是功能基因。比较就巢与产蛋SSH文库,发现就巢SSH库中参与细胞凋亡、信号转导及细胞结构的基因出现频率较高;产蛋特异性基因文库中参与物质能量代谢、细胞防御的基因较多;尚有许多差异片段属于未知功能蛋白或理论推定蛋白。结果提示,催乳素受体、抗苗勒管激素以及雌激素受体基因在就巢期上调表达可能与鹅就巢行为的启动与维持有关。该结果为进一步研究鹅就巢行为分子调控机制奠定基础。