基于噬菌体展示技术筛选抑制素α亚基特异性纳米抗体

【目的】通过噬菌体展示技术构建抗抑制素α亚基(INHα)纳米抗体文库,并筛选出针对绵羊INHα的特异性纳米抗体,以期制备出新型抑制素免疫制剂,为提高绵羊外周血促卵泡素(FSH)水平和排卵率做前期准备。【方法】利用pET32a-INHA原核表达载体诱导表达INHα蛋白,并对诱导表达的INHα蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定;用Ni琼脂糖凝胶纯化后的INHα蛋白免疫新疆双峰驼。通过巢式PCR扩增制备骆驼噬菌体展示纳米抗体文库,通过三轮免疫亲和淘选及噬菌体ELISA从该文库中富集和筛选INHα特异性纳米抗体,并通过测序得知纳米抗体的基因序列;用蛋白-蛋白模拟对接初步鉴定该纳米抗体与INHα蛋白的亲和性。【结果】通过原核诱导表达及Ni琼脂糖凝胶纯化得到了大小为36 ku的INHα重组蛋白,通过Western blotting检测到约36 ku的蛋白条带;双峰驼通过6次INHα蛋白免疫抗体效价达到1∶1024000;通过巢式PCR获得了400 bp左右的VHH基因,通过电转化等试验构建了库容量为1.05×10^(12)CFU的纳米抗体文库,文库阳性率为94%;通过三轮免疫亲和淘选获得3.0×10^(8)CFU的抗INHα纳米抗体文库,利用噬菌体ELISA获得了4株(VHH-4、VHH-29、VHH-89、VHH-108)INHα特异性纳米抗体,且4株INHα特异性纳米抗体基因序列相似度为80.31%;通过蛋白-蛋白模拟对接鉴定发现4株纳米抗体均与INHα具有较强的亲和性。此外,VHH-4与INHα的总自由能为-576.28 kJ/mol,是4种VHH中的最佳抗体。【结论】成功构建了抗INHα纳米抗体库,并从该库中获取了VHH-4、VHH-29、VHH-89和VHH-1084株INHα特异性纳米抗体。本研究结果可为纳米抗体在生殖免疫学中的应用提供参考。

抑制素α亚基特异性纳米抗体基因筛选与鉴定

【目的】从新疆双峰驼淋巴细胞基因组中筛选出抑制素α亚基(INHα)特异性纳米抗体(VHH)基因,制备新型抑制素免疫制剂,以期间接提高动物血液促卵泡素(FSH)水平、排卵率和产羔率。【方法】利用pET32a-INHA原核表达载体诱导表达INHα蛋白并纯化,纯化后的INHα蛋白经尿素溶液复性后免疫新疆双峰驼。通过对免疫前和免疫后全血中淋巴细胞VHH基因进行巢式PCR扩增、高通量测序并建立VHH氨基酸差异数据库;分别对免疫前和免疫后血清及从免疫后血清中筛选出的INHα特异性抗体进行液相色谱质谱/质谱联用(LC-MS/MS)分析获得质谱数据;对质谱数据进行蛋白数据库检索和数据分析后建立INHα特异性抗体和免疫后特异性抗体的肽段库和蛋白库;通过将VHH氨基酸差异数据库分别与INHα特异性抗体和免疫后特异性抗体的肽段库进行序列比对,筛选出INHα特异性纳米抗体基因;对筛选出的VHH基因进行序列比对、三维结构预测和蛋白-蛋白模拟对接。【结果】试验成功诱导表达并纯化了INHα蛋白,INHα蛋白免疫新疆双峰驼获得的抗体效价达1∶1024000;成功从淋巴细胞中克隆出VHH基因,从免疫后血清中筛选出INHα特异性抗体;通过高通量测序、质谱分析及数据处理筛选出5个INHα特异性VHH基因,其氨基酸序列比对结果显示,整体相似性为70.98%,其中互补决定区1(CDR1)长10~13个氨基酸,CDR2长12~13个氨基酸,CDR3长12~22个氨基酸,CDR3在3个互补决定区中氨基酸序列差异最大;系统进化树显示,选择的5条氨基酸序列具有丰富的多样性;蛋白-蛋白模拟对接结果表明,除VHH-267外其余4株纳米抗体均可与INHα配对连接,且主要作用力为疏水相互作用和氢键。【结论】本研究首次通过高通量测序技术联合质谱分析从新疆双峰驼淋巴细胞基因组中筛选出5个INHα特异性VHH基因。本研究结果可为提高动物机体FSH水平及排卵率提供理论指导和技术支持,对繁殖免疫学的发展具有一定参考价值。

绵羊颗粒细胞抑制素βA基因RNAi载体的构建

抑制素βA基因(Inhibin-βA,INHβA)的表达与绵羊(Ovisaries)的产羔数有一定关系。利用RNAi技术构建载体用来干扰INHβA的表达。根据GenBank上绵羊INHβA(GenBank:NW_004080167.1)mRNA的序列设计干扰片段4个PLLU2G-shINHβA-1(I-1)、PLLU2G--shINHβA-2(I-2)、PLLU2G-shINHβA-3(I-3)、PLLU2G-INHβA-4(I-4),其中I-2对INHβA表达的沉默效果最好。实验研究结果为绵羊繁殖性状和发情性状的研究奠定了良好的理论基础,构建的干扰载体有望进一步应用于提高绵羊繁殖性能的生产实践中。

含抑制素重组质粒的减毒猪霍乱沙门氏菌C500遗传稳定性研究

为了分析研究含抑制素重组质粒pVAX-IS-asd(以下简写为pXAIS)的crp(cAMP受体蛋白)和asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因双缺失猪霍乱沙门氏菌C500菌株的遗传稳定性。方法:将现有的无抗性抑制素重组表达质粒pXAIS转化入crp和asd基因双缺失猪霍乱沙门氏菌C500菌株(简称"空质粒株")中,得"含质粒株"。将"含质粒株"细菌在无选择压力条件下传代培养50代,利用酶切鉴定方法,分析"含质粒株"细菌中抑制素pXAIS质粒的稳定性;利用PCR方法扩增菌株("含质粒株"和"空质粒株")保守序列中invA基因,分析各代细菌的invA基因稳定性;通过比较传代培养后各代细菌的生长图型,分析"含质粒株"细菌传代后的生长规律。结果表明,"含质粒株"细菌连续传代50次后,仍能检出pXAIS质粒和invA基因,而且生长规律与"空质粒株"没有明显差异。说明含pXAIS质粒的猪霍乱沙门氏菌crp和asd基因双缺失株具有良好的遗传稳定性。

抑制素免疫及其在肉牛繁殖中的应用

为了研究抑制素(INH)免疫及其在肉牛繁殖中的应用,试验从INH的特性、来源、免疫原性、免疫方式等方面进行了综述,结果INH免疫在肉牛繁殖中有广阔的应用前景。

籽鹅与东北白鹅抑制素α-亚基成熟区编码序列的克隆与序列分析

为了成功扩增籽鹅与东北白鹅抑制素(INH)α-亚基成熟区cDNA基因,将籽鹅和东北白鹅编码序列的同源性与NCBI公布的鸡的对应序列进行比较,同源性分别为94.74%、94.44%。结果表明:利用T4 DNA连接酶将经SacⅠ和XhoⅠ酶切后的质粒连接到pET32a中,转化至BL21(DE3)感受态细胞后提取质粒,成功筛选出阳性表达质粒。

新疆肉用绵羊颗粒细胞抑制素βA基因RNAi载体的构建及其干扰效率验证

抑制素βA基因(inhibin-βA,INHβA)的表达与绵羊(Ovis aries)的产羔数有一定关系。为了观察INHβA对绵羊发情性状的影响以及在目的基因沉默后,引起的发情性状相关激素变化的情况,本研究利用RNAi技术构建载体干扰INHβA的表达。根据GenBank上绵羊INHβA(GenBank:NW_004080167.1)mRNA的序列设计干扰片段,通过酶切和测序验证,成功构建了4个INHβA基因RNAi质粒载体PLLU2G-shINHβA-1(I-1)、PLLU2G-shINHβA-2(I-2)、PLLU2G-shINHβA-3(I-3)、PLLU2G-shINHβA-4(I-4)和1个空载体(赛亚公司的PLLU2G)阴性对照;在成功分离卵巢颗粒细胞并建立培养体系后,利用Lip2000介导干扰载体转染细胞,通过荧光定量RT-PCR检测干扰前后INHβA的表达量。结果显示,4个干扰载体的干扰效率依次为34%,58%,39%,19%,其中I-2对INHβA表达的沉默效果最好。通过卵巢注射干扰载体I-2,检测干扰后绵羊血清INHβA、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和雌二酮(E2)的含量。结果显示,注射干扰载体后INHβA和FSH分别呈现明显的下降和上升波峰,而血清中LH和E2水平没有发生明显变化。

北京鸭抑制素α-亚基基因的序列分析

为了研究北京鸭抑制素α-亚基基因(INHα-亚基基因)成熟区编码序列的结构,为后续原核表达研究提供理论基础,试验采用RT-PCR法并以pMD18-T为载体克隆了INHα-亚基基因。结果表明:北京鸭INHα-亚基属于不稳定蛋白,亲水性较强,可在大肠杆菌中表达,而且该蛋白存在较多抗原决定簇,适合作为抗原使用。