仙居鸡抑制素/活化素β_B亚基成熟区cDNA的克隆及序列分析

根据发表的哺乳类抑制素 /活化素 βB亚基 c DNA序列设计引物 ,运用 RT- PCR技术从仙居鸡卵泡的颗粒细胞总RNA中扩增出抑制素 /活化素βB亚基成熟区序列 ,并进行了克隆和测序。结果显示 ,鸡成熟βB亚基是由 115个氨基酸(aa)残基组成的蛋白质 ,具有 9个半胱氨酸残基 ,与发表的哺乳类相应序列对比 ,其核苷酸序列的同源性为 79.7%～82 .9%,其编码氨基酸序列的同源性为 95 .7%～ 98.3%。 βB亚基成熟区半胱氨酸残基的数目和位置与发表的哺乳类相同。说明该亚基的序列及结构在不同物种间具高度保守性 ,提示抑制素 /活化素 βB亚基可能具重要的生理功能。

鸭卵泡及精巢中卵泡抑素和抑制素/活化素β_B亚基mRNA表达的研究

卵泡抑素是与抑制素／活化素功能密切相关的一种糖蛋白激素，采用定量竞争ＲＴ－ＰＣＲ 技术对鸭各级卵泡及成熟与未成熟精巢中的卵泡抑素和抑制素／活化素βＢ亚基的ｍＲＮＡ表达 丰度进行了研究，发现在上述组织中均有此两基因ｍＲＮＡ的表达，且只在小卵泡中表达较丰 富。卵泡抑素在小黄卵泡（ＳＹＦ）中表达量最高，以其ｍＲＮＡ的平均相对丰度为１．００，则Ｆ１（最 大卵泡）、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６～８、ＬＷＦ（大白卵泡）、ＴＩ（未成熟精巢）和ＴＭ（成熟精巢）中卵泡抑素 ｍＲＮＡ的平均相对含量分别为０．０１１±０．００４、０．０１９±０．００６、０．０２１±０．００９、０．０２８±０．００７、 ０．０７５ ± ０．０２３、０．１５ ± ０．０７２、０．２９ ± ０．０６８、０．０３７ ± ０．０１１和０．０１２±０．００４。βＢ亚基也在小黄卵 泡中表达量最高，以其ｍＲＮＡ的平均相对丰度为１．００，则 Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６－８、ＬＷＦ、ＴＩ和ＴＭ 中βＢ亚基ｍＲＮＡ的平均相对含量分别为：０．００９ ± ０．００３、０．０１３±０．００５、０．０１９ ± ０．００７、０．０２３ ± ０．００６、０．２９±０．０８４、０．８４±０．

东北白鹅抑制素/活化素β_B亚基成熟区cDNA的克隆

利用RT-PCR技术从东北白鹅卵泡的总RNA中扩增出了抑制素βB亚基成熟区序列,经RCR扩增出357bp片段,该片段与pMD18-T载体连接,转化到JM109感受态细胞,所得阳性克隆进行双酶切鉴定和PCR鉴定,并进行了测序分析,获得的克隆序列与设计的序列一致。

鸭各级卵泡中抑制素α和抑制素/活化素β_A亚基信使RNA表达丰度的研究

采用非常灵敏的定量竞争 ＲＴ－ＰＣＲ技术对鸭各级卵泡中抑制素α和βＡ亚基的ｍＲＮＡ表达丰度作了研究，发现在各级卵泡中均有此两亚基ｍＲＮＡ的表达，大卵泡中的α亚基表达量要高于βＡ亚基。α亚基ｍＲＮＡ在小黄卵泡（ＳＹＦ）中表达量最高，以其ｍＲＮＡ的平均相对丰度为１．００，则Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４／５、ＬＷＦ（大白卵泡）中α亚基ｍＲＮＡ的平均相对含量分别为： ０.２６±０．０５、０．２８±０．０７、０．５７±０．１２、０．９８±０．０９、０．０２６±０．００６。βＡ亚基 ｍＲＮＡ在Ｆ１中表达量最高，以其ｍＲＮＡ的平均相对丰度为１．００，则 Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４／５、ＳＹＥ、ＬＷＦ中βＡ亚基ｍＲＮＡ的平均相对含量分别为：０．２１８±０．０９、０．１１１±０．０３、０．０５８±０．０１１、０．０５３±０．０１３、０．００５±０．００２。结果显示，随着卵泡的增大α亚基表达量降低， βＡ亚基却增加，说明在卵泡发育过程中， α和βＡ亚基的表达是独立调节的，另外，βＡ亚基在Ｆ１中的大量表达，说明Ｆ１可能是形成二聚体抑制素／活化素的主要场所。

仙居鸡抑制素/活化素β_A亚基成熟区的cDNA克隆及序列分析

本研究根据发表的来航鸡抑制素 /活化素βA 亚基序列设计引物 ,运用RT PCR技术从仙居鸡卵泡的颗粒细胞总RNA中扩增出抑制素 /活化素βA 亚基成熟区序列 ,并进行了克隆和测序。结果显示 ,所测鸡成熟βA 亚基是由 116个氨基酸 (aa)残基组成的蛋白质 ,共有 9个半胱氨酸残基 ,与发表的鸡及哺乳类相应序列对比 ,其核苷酸序列的同源性分别为 99.2 %和 81%～ 85 .2 % ,其预测氨基酸序列的同源性分别为 10 0 %和 96 .6 %～ 97.4 % ,且所测鸡 βA 亚基成熟区半胱氨酸残基的数目和位置与发表的鸡和哺乳类相同 ,说明该亚基的序列及结构在不同物种间具高度保守性 。

抑制素B亚基在小鼠睾丸和脑组织中的表达及分布

目的探讨抑制素B(INH-B)在不同周龄小鼠睾丸和脑组织中的含量变化及α和β亚基在组织中的分布。方法购买1周龄、4周龄、8周龄和28周龄的雄性C57BL/6小鼠各6只。颈椎脱颈致死后分离小鼠睾丸和脑组织,4℃条件下收集组织匀浆上清,ELISA试剂盒方法检测INH-B含量,蛋白免疫印迹(WB)方法检测INH-Bα和β亚基在组织中的分布。结果 ELISA结果显示,睾丸中的INH-B含量随小鼠周龄增长而上升,在成年小鼠(8周龄)达到峰值,28周龄小鼠水平下降,差异有统计学意义(P<0.05);而脑组织中的INH-B含量在不同周龄小鼠中无显著性差异(P>0.05)。WB结果显示:α亚基单克隆抗体检测识别的蛋白形式在睾丸和脑组织中有所不同,40KD蛋白条带出现在所有小鼠睾丸和脑组织中,39KD和37KD出现在新生1周龄雄性小鼠脑组织中,26KD出现在各周龄小鼠睾丸中;β亚基单克隆抗体检测识别的蛋白主要有17KD、26KD、40KD、55KD以及70KD几种形式,其中26KD蛋白条带仅明显存在于1周龄和4周龄小鼠组织中。结论成熟小鼠脑组织和睾丸中INH-B含量丰富,不同周龄小鼠睾丸和脑组织中α和β亚基的单克隆抗体识别的蛋白条带形式有所不同。

人抑制素βB亚基单克隆抗体的制备和鉴定

目的：人抑制素βＢ亚基单克隆抗体（单抗）的制备和鉴定。方法：以化学合成人抑制素βＢ（１－ ２８） 和（８５－１１５）多肽片段和粗提猪卵泡抑制素免疫ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠，经细胞融合与筛选，得到分泌单抗的细胞株，诱生腹水后采用特定的免疫学方法进行鉴定。结果：获得４ 株能分泌单抗的细胞株，ＥＬＩＳＡ 检测腹水效价为１ ×１０－４ ～１ ×１０－ ６，与α、βＡ亚基片段及其他多肽激素无交叉反应，３ 株ＭｃＡｂ（ 抗ＩＮＨβＢ（８５－ １１５）） 识别同一抗原位点。相对亲和力３Ｅ８＞５Ｅ１１＞７Ｂ９。腹水中的抗体能明显地被人卵泡液，猪卵泡液和βＢ（８５ －１１５）ＢＳＡ 中和而呈抑制曲线。

去势小鼠血清和脑组织中抑制素B的含量及分布变化

目的分析去势小鼠血清和脑组织中抑制素B(INH-B)水平变化及INH-B亚基在脑组织中的分布。方法将4周龄去势小鼠(睾丸切除,去势组)及正常(对照组)雄性C57BL/6小鼠各12只分别喂养至8周龄(去势后4周)和12周龄(去势后8周)后,收集每只小鼠血清约50μl,并用10%水合氯醛麻醉后开胸进行生理盐水及4%多聚甲醛灌注,然后分离脑组织;仅生理盐水灌注者在4°C条件下收集组织匀浆上清,而继续4%多聚甲醛灌注者将脑组织置于4%多聚甲醛溶液中继续固定保存,石蜡包埋切片。ELISA方法检测两组小鼠血清及脑组织匀浆上清中INH-B含量,免疫荧光方法检测INH-B亚基在脑组织中的定位分布。结果ELISA结果显示,去势组小鼠血清及脑组织匀浆上清中INH-B含量均显著低于对照组(P<0.05),尤其血清中INH-B水平低于检测下限值(<4 pg/ml),但同组小鼠在8周和12周两个时间点的水平变化均无显著性差异(P>0.05)。免疫荧光实验结果显示,去势后小鼠脑组织中INH-Bα亚基和β亚基的信号强度明显减弱。结论去势小鼠体内INH-B维持一个极低水平的状态,提示雄性小鼠INH-B主要来源于睾丸,也可能存在着睾丸外来源。

绵羊INHBB、SMAD4和FGF18基因的双荧光素酶载体构建及其与miR-370-3p的靶向验证

为研究绵羊输卵管功能相关的oar-miR-370-3p与抑制素亚基βB(inhibin subunit beta B,INHBB)、SMAD家族成员4(SMAD family member 4,SMAD4)和成纤维细胞生长因子18(fibroblast growth factor 18,FGF18)基因之间的靶向关系,本研究对多个物种(绵羊、人、小鼠、大鼠、猕猴、豚鼠和兔)中miR-370-3p的序列进行了比对,利用RNAhybrid程序预测绵羊miR-370-3p与INHBB、SMAD4和FGF18基因的3′UTR可能存在的结合位点,随后分别构建INHBB、SMAD4和FGF18基因3′UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,并将其与miR-370-3p mimics、mimics NC共转染至HEK293T细胞,检测双荧光素酶活性。结果表明,绵羊miR-370-3p序列与其他6个物种不同,但具有一定的保守性。RNAhybrid程序预测到oar-miR-370-3p与INHBB、SMAD4和FGF18基因的3′UTR存在结合位点。PCR扩增结果和测序结果表明,INHBB、SMAD4和FGF18基因3′UTR的野生型和突变型载体构建成功。共转染INHBB、SMAD4和FGF18野生型载体和miR-370-3p mimics的双荧光素酶活性极显著或显著低于相应的对照组(P<0.01;P<0.05);而3种突变型载体和miR-370-3p mimics共转染的双荧光素酶活性均与相应的对照组无显著差异(P>0.05)。表明INHBB、SMAD4和FGF18基因的3′UTR区域均能与miR-370-3p结合并抑制双荧光素酶活性,验证了INHBB、SMAD4和FGF18基因均是miR-370-3p的靶基因,为进一步研究oar-miR-370-3p影响绵羊输卵管功能与绵羊繁殖力的分子机制提供依据。

大足黑山羊与萨能奶山羊在发情周期内INH B、ACT A和FSH浓度变化

为了研究发情周期内血浆INH B（Inhibin B）、ACT A（Activin A）和FSH（Follicle stimulating hormone）浓度与山羊繁殖力之间的关系,以高繁殖力的大足黑山羊和低繁殖力的萨能奶山羊为研究对象,采用酶联免疫法（ELISA）测定血浆中INH B、ACT A和FSH浓度,比较两个山羊品种在一个发情周期内血浆中INH B、ACT A和FSH的分泌变化规律。研究结果显示：大足黑山羊和萨能奶山羊血浆中FSH的分泌与ACT A呈正相关,与INH B呈负相关,大足黑山羊在整个发情周期内血浆中的FSH平均浓度高于萨能奶山羊,INH B和ACT A平均浓度均低于萨能奶山羊。从发情症状明显至排卵前这段时间内,大足黑山羊血浆中FSH平均浓度显著高于萨能奶山羊（P〈0.05）。结果表明,发情周期内INH B、ACT A与FSH的差异可能是导致大足黑山羊和萨能奶山羊繁殖力差异的根本原因之一。推测ACT A主要作用可能是延长卵泡期,对于山羊排卵个数的影响不起主导作用。INH B可以抑制FSH的水平,从而间接的影响排卵数。

不同繁殖力山羊血浆中INHB、ACTA和FSH变化规律的研究

实验以高繁殖力的大足黑山羊和繁殖力较低的萨能奶山羊为研究对象,比较2个山羊品种在一个发情周期内血浆中抑制素B（INHB）、活化素A（ACTA）和促卵泡激素（FSH）的分泌变化规律,旨在研究这3种激素与山羊繁殖力之间的关系。结果表明：大足黑山羊和萨能奶山羊血浆中FSH的分泌与ACTA呈正相关（P〈0.01,P=0.361）,与INHB呈负相关（P=0.022,P=0.005）,大足黑山羊在整个发情周期内血浆中FSH、ACTA平均浓度略高于萨能奶山羊（P〉0.05）,而INHB平均浓度显著低于萨能奶山羊（P〈0.05）。从发情征状明显至排卵前这段时间内,大足黑山羊血浆中FSH平均浓度显著高于萨能奶山羊（P〈0.05）。结果提示,大足黑山羊卵泡期比萨能奶山羊长,发情周期内INHB与FSH的差异可能是导致大足黑山羊和萨能奶山羊繁殖力差异的根本原因之一。