血红素加氧酶-1基因修饰的骨髓间质干细胞抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的实验研究

目的探讨骨髓间质干细胞携带的血红素加氧酶-1(HO-1)基因于体外共培养体系中抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的效果及机制。方法采用核转染技术将HO-1质粒转染至骨髓间质干细胞,共培养肺动脉平滑肌细胞和骨髓间质干细胞,评估5-羟色胺刺激后的平滑肌细胞增殖情况,检测5-羟色胺刺激后平滑肌细胞中RhoA的活性。结果 5-羟色胺可刺激肺动脉平滑肌细胞增殖,使单纯培养的平滑肌细胞总数较对照组增加2.40倍(P<0.01)。野生型骨髓间质干细胞与肺动脉平滑肌细胞共培养并不能抑制平滑肌细胞的增殖,而携带HO-1基因的干细胞则可明显抑制5-羟色胺刺激的平滑肌细胞增殖,使平滑肌细胞总数降至对照组的1.56倍(P<0.05);5-羟色胺可引起肺动脉平滑肌细胞中RhoA活性增加2.90倍,野生型干细胞与肺动脉平滑肌细胞共培养并未能改变5-羟色胺刺激的RhoA激活,但在携带HO-1基因的干细胞共培养体系中5-羟色胺诱发的RhoA活性明显降低。结论骨髓间质干细胞携带的HO-1基因可以旁分泌的形式抑制平滑肌细胞的增殖,其作用的机制可能与其产生的CO通过激活cGMP信号通路进而抑制RhoA的激活有关。HO-1可作为外源基因导入体内治疗肺动脉高压。

血管钠肽抑制肺动脉平滑肌细胞增殖及调控钠尿肽B受体表达的研究

目的 :探讨血管钠肽 (VNP)对肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)增殖及钠尿肽 B受体 (NPR-B)基因表达的影响。方法 :体外培养大鼠 PASMC,分别用噻唑蓝 (MTT)比色法、总蛋白含量测定、放免分析及打点杂交的方法 ,观察了VNP作用下 PASMC的 MTT吸光值、总蛋白含量、细胞内 c GMP、c AMP浓度和 NPR-B的 m RNA水平。结果 :VNP可以显著抑制血清刺激的 PASMC增殖 ,升高细胞内 c GMP浓度及 NPR-B m RNA水平 ,但对细胞内 c AMP浓度无明显影响。结论 :VNP对 PASMC增殖及 NPR-B基因表达具有调控作用 ,并且可能通过 c

SIRT1/FOXO3a/p27信号通路在白藜芦醇抑制肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的探讨白藜芦醇(RES)是否通过影响沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)/叉头蛋白O3a(FOXO3a)/p27信号通路抑制肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖,为肺动脉高压新药研发提供一定的理论和实验依据。方法体外培养大鼠PASMC并随机分为三组,对照组不处理,5-HT刺激组加1μmol/L 5-HT,不同浓度RES干预组在加入5-HT前用10、30、100、300μmol/L RES预处理1 h,作用24 h后采用BrdU掺入法检测各组细胞增殖情况并筛选RES作用浓度;为研究机制进一步将PASMCs分为六组,对照组、5-HT刺激组、RES干预组(筛选出的RES作用浓度)处理同前,RES+SIRT1抑制剂干预组、RES+FOXO3a抑制剂干预组在加入1μmol/L 5-HT前用RES分别联合1μmol/L EX527、AS1842856预处理1 h,RES+p27 siRNA转染组在加入1μmol/L 5-HT前预先转染p27 siRNA 24 h后联合RES;作用24 h后采用BrdU掺入法检测各组细胞增殖情况,采用Western blotting法检测对照组、5-HT刺激组、RES干预组、RES+SIRT1抑制剂干预组的FOXO3a、p27蛋白及RES+FOXO3a抑制剂干预组的p27蛋白。结果PASMC增殖率5-HT刺激组高于对照组,100、300μmol/L RES干预组均低于5-HT刺激组(P均<0.05),故以100μmol/L作为后续实验中RES干预的作用浓度。PASMC增殖率5-HT刺激组高于对照组,RES干预组低于5-HT刺激组;RES+SIRT1抑制剂干预组、RES+FOXO3a抑制剂干预组、RES+p27 siRNA转染组均高于RES干预组(P均<0.05),三组间差异无统计学意义。PASMC中FOXO3a、p27蛋白表达量5-HT刺激组均低于对照组,RES干预组均高于5-HT刺激组,RES+SIRT1抑制剂干预组均低于RES干预组(P均<0.05);RES+FOXO3a抑制剂干预组p27蛋白表达量低于RES干预组(P<0.05)。结论RES可通过激活SIRT1上调FOXO3a,进而上调细胞周期抑制蛋白p27,最终抑制PASMC增殖。

apelin抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的分子机制研究

目的:明确apelin对PASMC增殖的影响,并探讨相关的分子机制,为肺动脉高压新药的研发提供一定的理论和实验依据。方法:体外培养大鼠PASMC,采用TGF-β1刺激原代PASMC增殖,给予apelin干预,应用Western blot检测细胞中Smad2/3的磷酸化水平以及cyclin D1的蛋白水平,BrdU掺入法检测各组细胞增殖情况。结果:apelin干预组Smad2/3的磷酸化水平低于TGF-β1刺激组(P<0.05)。APJ siRNA转染组Smad2/3的磷酸化水平高于apelin干预组(P<0.05)。apelin干预组cyclin D1蛋白水平低于TGF-β1刺激组(P<0.05)。SB431542干预组cyclin D1蛋白水平高于apelin干预组(P<0.05)。apelin干预组PASMC增殖率低于TGF-β1刺激组(P<0.05)。APJ siRNA转染组、SB431542干预组及cyclin D1 siRNA转染组PASMC增殖率均高于apelin干预组(P<0.05)。结论:apelin可通过与其受体APJ结合,进而调节TGF-β1/Smad/cyclin D1轴抑制PASMC的增殖。apelin对PASMC增殖的抑制作用以及潜在机制为研发新的靶向药物提供了思路。

AMPK激动剂AICAR通过阻滞细胞周期于G_0/G_1期抑制肺动脉平滑肌细胞增殖

目的建立PDGF-BB诱导的原代大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary vascular smooth musclecells，PASMCs）的增殖细胞模型，通过AMPK激动剂AICAR干预，探讨AICAR对PASMCs细胞周期和增殖的影响及其机制，为肺血管重构防治寻找靶点。方法通过20ng／mlPDGF-BB刺激诱导PASMCs增殖建立细胞模型，采用AICAR（0．5mmol／L）干预PDGF-BB诱导的PASMCs增殖，Westernblot法检测总的和磷酸化的AMPK，CCK-8检测PASMCs增殖，流式细胞仪分析细胞周期，实时定量PCR（RT-PCR）检测cyclinDl、cyclinE、CDK2／4／6mRNA的表达。结果Westernblot法检测表明AICAR可以活化AMPK，CCK-8检测结果表明AICAR能够抑制PDGF-BB诱导的PASMCs增殖；流式细胞仪检测结果表明AICAR能够抑制细胞周期于G0／G1期，RT-PCR结果表明AICAR可以抑制cyclinDl、cyclinE、CDK2、CDK4和CDK6的mRNA的表达。结论AICAR通过抑制cy-clinDl、cyclinE、CDK2／4／6的mRNA表达阻滞细胞周期于G0／G1-S期，抑制PASMCs增殖。

二苯乙烯苷抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的机制研究

目的 建立PDGF-BB诱导的原代大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary vascular smooth muscle cells,PASMCs）增殖的细胞模型,并探讨二苯乙烯苷（2,3,5,4-tetrahydroxyl diphenylethylene-2-o-glucoside,TSG）对PASMCs增殖的影响及其机制,为肺血管重构防治寻找新药物.方法 采用酶消化法分离培养大鼠原代PASMCs,通过20ng/ml PDGF-BB诱导PASMCs增殖建立细胞模型,采用1 ～ 100μmol/L TSG干预PDGF-BB诱导的PASMCs增殖,通过CCK-8检测PASMCs增殖及TSG的细胞毒作用,BRDU检测DNA的合成,流式细胞仪分析细胞周期,实时定量PCR（RT-PCR）检测CyclinD1、CyclinE、CDK2/4/6 mRNA的表达,Western blot法检测总的和磷酸化AKT/GSK3β的表达.结果 CCK-8检测结果表明TSG抑制PDGF-BB诱导的PASMCs增殖及DNA合成具有浓度依赖性,并且实验浓度的TSG对PASMCs无明显毒性不良反应;流式细胞仪分析结果表明TSG能够阻滞细胞周期于G0/G1～S期,RT-PCR结果表明TSG能够抑制CyclinD1、CyclinE、CDK2/4/6 mRNA的表达;Westernblot法检测结果表明TSG能够抑制AKT/GSK3β活化.结论 TSG通过阻滞细胞周期于G0/G1～S抑制PDGF-BB诱导的PASMCs增殖.TSG抑制PASMCs增殖与抑制AKT/GSK3β信号通路的活化有关.

DPP-4抑制剂通过Nrf2/HO-1/P21信号通路抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的分子机制研究

目的明确DPP-4抑制剂西格列汀对肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响,并探讨相关的分子机制。方法体外培养大鼠PASMCs并随机分为对照组、5-HT组、不同浓度(2.5,5,10,20,40μmol/L)西格列汀预处理+5-HT组,应用BrdU试剂盒检测各组细胞增殖情况并筛选西格列汀作用浓度;用西格列汀刺激PASMCs 24 h,应用Western blot检测细胞中Nrf2及HO-1的蛋白水平。为进一步研究信号通路机制,PASMCs分为对照组、5-HT组、西格列汀+5-HT组、Nrf2抑制剂ML385+西格列汀+5-HT组、HO-1抑制剂SnPP+西格列汀+5-HT组、P21 siRNA预转染+西格列汀+5-HT组,采用BrdU掺入法检测各组细胞增殖情况,应用Western blot检测各组细胞中P21的蛋白水平。结果20 mol/L西格列汀+5-HT组PASMCs增殖率明显低于5-HT组(P<0.05),且20μmol/L西格列汀作用24 h,Nrf2及HO-1的蛋白表达均高于对照组(P<0.05)。进一步机制研究发现,与5-HT组相比,西格列汀+5-HT组的P21表达水平升高(P<0.05),而预先给予Nrf2或HO-1抑制剂联合西格列汀,P21水平的上调被逆转(P<0.05)。而且预先联合Nrf2或HO-1抑制剂或预转染P21 siRNA,西格列汀对PASMCs增殖的抑制作用也被逆转(P<0.05)。结论DPP-4抑制剂西格列汀可通过激活Nrf2/HO-1/P21信号通路,进而抑制PASMCs增殖。

METTL3-m6A途径抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的实验研究

目的探索甲基转移样酶3(METTL3)依赖的6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰在体外调控肺动脉平滑肌细胞增殖中的功能。方法培养SD大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),采用siRNA敲低METTL1的表达。根据转染siRNA的不同分为siNC组(对照siRNA转染组)与siMETTL1组(METTL3 siRNA转染组)。两组PASMCs分别经过siNC及siMETTL1转染后加入含20%FBS的DMEM完全培养液诱导细胞发生增殖。通过试剂盒比色法检测两组PASMCs的m6A总体修饰差异、通过CCK-8细胞活性检测及EdU细胞增殖实验检测两组PASMCs增殖能力改变。结果与siNC组比较,siMETTL3组METTL1的基因表达[(1.0±0.1)vs(0.4±0.1)]及蛋白表达[(1.81±0.05)vs(1.35±0.09)]发生显著下调,差异均有统计学意义(P<0.05);且与siNC组比较,siMETTL3组PASMCs的m6A修饰发生显著下调[(0.10±0.01)vs(0.03±0.01)]、细胞活力显著下降[(0.35±0.01)vs(0.11±0.01)]、Ed U+细胞数显著降低[(48.22±2.92)vs(30.29±1.78)],差异均有统计学意义(P<0.05)。结论敲低METTL3的表达可下调m6A修饰并抑制PASMCs的增殖功能。

Nrf2调控的氧化应激在Adropin抑制低氧肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用研究

目的 观察Adropin对低氧诱导的SD大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖及氧化应激的影响,并探讨其可能机制。方法 以1%的O_(2)作为诱导剂,建立PASMCs增殖及氧化应激的细胞模型,通过活性氧(ROS)激活剂H_(2)O_(2),抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)及不同浓度Adropin(100、300、1000 nmol·L^(-1))干预24 h后,检测细胞增殖及ROS,筛选Adropin抑制增殖及氧化应激的最适浓度。选择1000 nmol·L^(-1) Adropin和/或核因子E2相关因子2(Nfr2)抑制剂ML385在低氧条件下孵育PASMCs 24 h,并设置Nrf2激活剂富马酸二甲酯(DMF)作为阳性对照组,通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖;DCFH-DA探针联合荧光酶标仪测定细胞内ROS的水平;试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)的水平;流式细胞仪检测细胞周期;Western blot检测Nrf2、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、Cyclin E的表达。结果 与对照组相比较,H_(2)O_(2)及低氧均能够诱导PASMCs增殖及ROS生成,而不同浓度的Adropin(100、300、1000nmol·L^(-1))和NAC均可抑制低氧诱导的PASMCs增殖及ROS产生,且Adropin抑制增殖及ROS产生具有浓度依赖性。与低氧组相比较,DMF或Adropin(1000 nmol·L^(-1))干预后,PASMCs增殖及细胞内ROS水平下降,SOD、GPx、CAT活性增加,MDA水平下降,Nrf2表达上调(P<0.05),而ML385能够逆转Adropin的上述作用(P<0.05);DMF或Adropin能够通过抑制Cyclin D1与Cyclin E的表达,阻滞细胞周期于G_(0)/G_(1)期,从而抑制PASMCs增殖(P<0.05),而ML385能够逆转Adropin上述作用(P<0.05)。结论 Adropin可通过抑制氧化应激抑制低氧诱导的PASMCs增殖,其机制可能与激活Nrf2有关。

吲哚-3-甲醇通过抑制mTOR/HIF-1α信号通路减弱低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖

目的观察吲哚-3-甲醇(I3C)对低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的作用。方法采用0.2%Ⅰ型胶原酶消化分离SD大鼠PASMCs,以低氧(1%O2)作为诱导剂,建立PASMCs增殖的细胞模型,以不同浓度的I3C(25、50、100、200μmol·L^(-1))干预24 h,检测细胞增殖及存活率;设置哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂rapamycin或缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)抑制剂LW6为阳性对照组,以100μmol·L^(-1 )I3C,HIF-1α稳定剂DMOG或mTOR激活剂MHY1485干预24 h后,CCK-8试剂盒检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞周期;Western blot检测HIF-1α、总的mTOR及磷酸化的mTOR和细胞周期调控相关蛋白的表达,确定I3C抑制PASMCs增殖的作用机制。结果25~100μmol·L^(-1 )I3C抑制低氧诱导的PASMCs增殖的作用具有浓度依赖性(P<0.05),而100μmol·L^(-1)与200μmol·L^(-1 )I3C抑制细胞增殖的作用无明显差异,且I3C无明显细胞毒性作用。I3C(100μmol·L^(-1))与LW6均可抑制低氧诱导的PASMCs增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,抑制HIF-1α、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、Cyclin E、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)2、CDK4和CDK6的表达(P<0.05),且DMOG能够逆转I3C的上述作用(P<0.05)。另外I3C与rapamycin在抑制低氧诱导的PASMCs增殖与mTOR/HIF-1α信号通路活化方面作用相似,且MHY1485能够逆转I3C抑制细胞增殖及mTOR/HIF-1α信号通路活化的作用(P<0.05)。结论I3C可通过抑制mTOR/HIF-1α信号通路减弱低氧诱导的PASMCs增殖。

虎杖苷调节YAP1/TAZ信号通路对缺氧性肺动脉高压新生大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探究虎杖苷(PD)对缺氧性肺动脉高压(HPH)新生大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法 将新生大鼠随机分为6组:对照组、模型组、PD低剂量组、PD中剂量组、PD高剂量组、PD高剂量+Hippo通路抑制剂(PD高剂量+XMU-MP-1)组,每组10只。缺氧2周后,检测各组大鼠右心室收缩压(RVSP)和右心室肥厚指数(RVHI),苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化,并计算肺动脉管壁厚度占总厚度的百分比(WT%)和管壁面积占总面积的百分比(WA%)。分离各组新生大鼠PASMCs,分为NC组、低氧(Hypoxia)组、PD低剂量组、PD中剂量组、PD高剂量组、PD高剂量+XMU-MP-1组。CCK-8和EdU检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫印迹(Western blot)检测肺组织和PASMCs中Yes相关蛋白1(YAP1)、PDZ结合域的转录共刺激因子信号通路(TAZ)、哺乳动物不育系20样激酶1(MST1)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)蛋白表达。结果 与对照组相比,模型组大鼠肺动脉管壁明显增厚,管腔变窄,RVSP、RVHI、WT%、WA%、YAP1、MST1、TAZ蛋白表达显著升高(均P<0.05);与模型组相比,PD低、中、高剂量组大鼠肺动脉增厚减少,管腔变大,RVSP、RVHI、WT%、WA%、YAP1、MST1、TAZ蛋白表达显著降低,且PD各组间差异存在剂量依赖性(均P<0.05);XMU-MP-1可逆转这一结果。与NC组相比,Hypoxia组细胞A_(450nm)值、EdU阳性率、YAP1、MST1、TAZ、Bcl-2蛋白表达显著升高,凋亡率、Bax蛋白表达显著降低(均P<0.05);与Hypoxia组相比,PD低、中、高剂量组细胞A_(450nm)值、EdU阳性率、YAP1、MST1、TAZ、Bcl-2蛋白表达显著降低,凋亡率、Bax表达显著升高,且PD各组间有剂量依赖性(均P<0.05);XMU-MP-1可逆转这一结果。结论 PD可能通过抑制YAP1/TAZ信号通路抑制HPH新生大鼠PASMCs增殖,促进凋亡。

低氧预处理脐带间充质干细胞源外泌体抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖

背景:已有研究表明外泌体可以改善低氧性肺动脉高压,而且不同来源、不同环境的外泌体功能存在显著差别。低氧预处理脐带间充质干细胞来源外泌体对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响尚不清楚。目的:探讨低氧预处理人脐带间充质干细胞来源外泌体对低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响。方法:采用组织贴壁法分离培养原代人脐带间充质干细胞,用超滤法提取人脐带间充质干细胞来源外泌体;采用组织消化法分离大鼠肺动脉平滑肌细胞,用CCK-8法测定不同质量浓度外泌体干预肺动脉平滑肌细胞不同时间后的细胞增殖抑制率,确定外泌体作用的适宜质量浓度和干预时间。将第3代肺动脉平滑肌细胞分为常氧对照组、低氧对照组、低氧+常氧外泌体处理组和低氧+低氧外泌体处理组,EdU法检测各组细胞增殖情况,Western blot检测各组细胞核增殖抗原蛋白表达水平。结果与结论:①与常氧对照组相比,低氧对照组肺动脉平滑肌细胞增殖能力明显增加;与低氧对照组相比,低氧+常氧外泌体组细胞增殖能力下降,且低氧+低氧外泌体组增殖能力下降更明显;②与常氧对照组相比,低氧对照组细胞的细胞核增殖抗原蛋白表达升高;与低氧对照组相比,低氧+常氧外泌体组细胞核增殖抗原蛋白表达水平稍微降低,低氧+低氧外泌体组细胞核增殖抗原蛋白表达水平明显降低;③结果表明,低氧预处理人脐带间充质干细胞来源外泌体具有抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的能力。

铁蛋白自噬抑制调控低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖

目的探究低氧诱导小鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)游离铁减少的机制及其在PASMCs增殖和肺血管重塑中的作用。方法①体外培养原代小鼠PASMCs,分为常氧组(C)、常氧柠檬酸铁铵组(C+FAC)、常氧雷帕霉素组(C+R)、低氧组(H)、低氧柠檬酸铁铵组(H+FAC)、低氧雷帕霉素组(H+R)。C组、C+FAC组和C+R组置于常氧(21%O_(2))环境中培养48 h,H组、H+FAC组和H+R组置于低氧(1%O_(2))环境中培养48 h。C+FAC组和H+FAC组使用柠檬酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)处理,C+R组和H+R组使用雷帕霉素(rapamycin)处理。检测各组细胞增殖情况,细胞内游离铁含量,铁调节蛋白(iron regulatory proteins,IRPs)、转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFR)、铁转运蛋白(ferroportin,FPN)和铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)等铁稳态调节蛋白表达水平。②将24只C57/BL6N小鼠(雄性,6周龄,体质量18~22 g)分4组:常氧组(C-4W)、常氧高铁饮食组(C+HID-4W)、低氧组(H-4W)和低氧高铁饮食组(H+HID-4W)(n=6);H-4W组与H+HID-4W组置于模拟海拔5000 m低压低氧环境中4周。检测各组小鼠右心功能,右心室收缩压,以及肺血管重塑变化。结果与C组相比,H组PASMCs增殖活性显著增强(P<0.01),细胞内游离铁含量显著减少(P<0.01),FTH的蛋白水平显著上调(P<0.01)。与H组相比,H+FAC组PASMCs内游离铁含量显著增加(P<0.01),细胞增殖活性显著降低(P<0.01)。与H组相比,H+R组PASMCs内游离铁含量显著增加(P<0.01),细胞增殖活性显著降低(P<0.05),FTH的蛋白水平显著降低(P<0.05)。与H-4W组相比,H+HID-4W组小鼠的右心功能显著改善(P<0.01),右心室收缩压显著降低(P<0.05),右心肥厚显著减轻(P<0.01),肺动脉增厚显著抑制(P<0.01)。结论低氧通过抑制铁蛋白自噬途径,介导游离铁减少,进而促进PASMCs增殖以及肺动脉重塑。

基因沉默SIRT7抑制缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖及迁移

目的研究沉默信息调节因子2相关酶类7(silent information regulator 2 related enzyme 7,SIRT7)对低氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary artery smooth muscle cells,HPASMCs)增殖和迁移的调控作用,并探讨可能的分子作用机制。方法体外培养HPASMCs建立低氧模型。通过慢病毒介导的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默SIRT7在HPASMCs中的表达。实验分为4组:常氧对照组、低氧组、低氧+LV-sh-Ctrl组和低氧+LV-sh-SIRT7组。低氧+LV-sh-Ctrl组HPASMCs感染对照重组腺病毒LV-sh-Ctrl,然后进行低氧处理。低氧+LV-sh-SIRT7组HPASMCs感染表达SIRT7 shRNA的重组腺病毒LV-sh-SIRT7,然后进行低氧处理。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测SIRT7的mRNA表达水平。采用Western blotting检测SIRT7、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、转化生长因子β受体Ⅰ(transforming growth factor-βreceptorⅠ,TβRⅠ)、Smad2和Smad3的蛋白表达量。采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)实验检测细胞增殖。采用流式细胞术检测细胞凋亡。采用Transwell实验检测细胞迁移。结果与常氧对照组比较,低氧组和低氧+LV-sh-Ctrl组SIRT7表达水平显著升高(P<0.01),细胞增殖和迁移水平显著提高(P<0.01),细胞凋亡率显著降低(P<0.05);与低氧组和低氧+LV-sh-Ctrl组比较,低氧+LV-sh-SIRT7组SIRT7表达水平显著降低(P<0.01),细胞增殖和迁移水平显著下降(P<0.01),细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。与常氧对照组比较,低氧组和低氧+LV-sh-Ctrl组TGF-β1、TβRⅠ、p-Smad2和p-Smad3的蛋白表达量显著增加(P<0.01);与低氧组和低氧+LV-sh-Ctrl组比较,低氧+LV-sh-SIRT7组TGF-β1、TβRⅠ、p-Smad2和p-Smad3的蛋白表达量显著减少(P<0.01)。结论基因沉默SIRT7通过调控TGF-β1/Smad信号通路抑制缺氧诱导的HPASMCs增殖和迁移。

PPARδ的激活通过抑制糖酵解减轻PDGF-BB诱导的肺动脉平滑肌细胞表型转化

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)激动剂GW501516对血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)表型转化和糖酵解的影响及其机制。方法:以20μg/L PDGFBB作为诱导剂,建立PASMCs表型转化及糖酵解的细胞模型,通过GW501516或糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-DG)干预24 h,检测PASMCs表型和糖酵解的变化。设置缺氧诱导因子1α(HIF-1α)抑制剂LW6为阳性对照组,通过GW501516和(或)HIF-1α稳定剂二甲基草酰甘氨酸(DMOG)干预24 h,测定细胞外乳酸含量及葡萄糖摄取量的变化;检测PPARδ、血管平滑肌细胞表型标志蛋白、HIF-1α及糖酵解相关蛋白表达,探讨GW501516抑制PASMCs表型转化及糖酵解的机制。结果:PDGF-BB刺激可抑制PASMCs内PPARδ表达,而GW501516处理可促进PPARδ表达(P<0.05)。GW501516上调PASMCs收缩表型标志蛋白平滑肌22α蛋白(SM22α)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,下调合成表型标志蛋白波形蛋白(vimentin)和骨桥蛋白(OPN)表达,减少细胞外乳酸生成,抑制细胞对葡萄糖的摄取(P<0.05),而2-DG在抑制PASMCs表型转化及糖酵解方面的作用与GW501516相似。LW6和GW501516可抑制糖酵解与细胞表型转化,抑制HIF-1α、葡萄糖转运体1(GlUT1)、丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)、乳酸脱氢酶A(LDHA)和单羧酸转运体蛋白4(MCT4)表达,同时促进丙酮酸脱氢酶(PDH)表达(P<0.05),而DMOG可逆转GW501516的上述作用(P<0.05)。结论:PPARδ激动剂GW501516可通过抑制糖酵解而抑制PDGF-BB诱导的PASMCs表型转化,其机制可能与抑制HIF-1α的表达有关。

Hoxa1通过MEK/ERK信号通路促进低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移和表型转换的研究

背景 低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary arterial hypertension,HPH)是一种以血管阻力持续性升高和血管重塑为特征的进展性疾病。研究表明Hoxa1参与血管生成过程,但Hoxa1在调控肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)中的作用尚不明确。目的 本研究旨在确定Hoxa1对PASMCs增殖、迁移和表型转化的调控作用。方法 使用Ⅱ型胶原酶消化分离培养原代大鼠PASMCs。采用1%低氧处理细胞构建低氧诱导的细胞模型,并检测24 h、48 h、72 h低氧处理的PASMCs中Hoxa1 mRNA和蛋白表达水平。采用干扰或过表达Hoxa1慢病毒下调或上调细胞中Hoxa1表达。慢病毒干扰实验分为常氧组(Normoxia)、低氧组(Hypoxia)、低氧空病毒组(Hypoxia+shRNA-NC)、低氧Hoxa1干扰病毒组(Hypoxia+shRNA-Hoxa1);慢病毒过表达实验分为对照组(Control)、过表达空病毒组(LV-NC)、过表达Hoxa1组(LV-Hoxa1)。采用EdU检测细胞增殖能力;RT-qPCR检测Hoxa1 mRNA表达;Western blot检测Hoxa1、表型转化标志蛋白、MEK/ERK信号通路蛋白表达;免疫荧光检测Hoxa1、α-actin表达;免疫共沉淀实验确定Hoxa1与MEK的相互作用。结果 成功分离培养PASMCs,并鉴定细胞表达α-SMA。低氧诱导下PASMCs中Hoxa1表达上调(P<0.05)。低氧下Hoxa1沉默抑制PASMCs增殖和迁移,而常氧下Hoxa1过表达促进PASMCs增殖和迁移(P均<0.05)。低氧下沉默Hoxa1导致Hypoxia+shRNA-Hoxa1组收缩型标志蛋白表达升高,合成型标蛋白表达降低(P<0.05)。而在常氧下过表达Hoxa1导致LV-Hoxa1组收缩型标志蛋白降低,合成型标志蛋白升高(P均<0.05)。此外,Hoxa1表达增加促进MEK/ERK信号通路激活。免疫共沉淀结果显示,Hoxa1与MEK存在相互作用。结论 Hoxa1可能通过激活MEK/ERK通路促进PASMCs增殖、迁移和表型转化。

参与肺动脉平滑肌细胞增殖信号转导机制及信号转导抑制剂的研究进展

肺动脉高压是一种以肺血管阻力升高为特征,最终导致右心功能严重受限、衰竭甚至死亡的慢性进展性疾病。其组织病理学改变主要以肺血管重构为特点,而肺动脉平滑肌细胞在外周血管的异常增殖是肺血管重构的主要病理基础。该文主要对参与肺动脉平滑肌细胞增殖信号转导机制及信号转导抑制剂的研究进展作一综述。

红景天甙对低氧培养的兔肺动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的 :研究红景天甙 (Salidroside ,Sal)对低氧 ( 3 % )条件下兔肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)增殖、DNA合成、细胞内钙离子浓度的影响。方法 :应用细胞培养、四唑盐比色试验 (MTT)、[3H]-胸腺嘧啶核苷 ( [3H]-TdR)掺入试验、Fluo- 3和激光扫描共聚焦显微术测定细胞内Ca2 +浓度等方法。结果 :低氧 2 4h可直接刺激PASMC ,使MTT的A值增加 62 % (P <0 0 5 ) ,[3H]-TdR掺入量增加 13 8% (P <0 0 1)。在低氧的PASMC培养液中加入Sal( 3 2× 10 -5mol/L)可抑制低氧的这种促增殖作用 ,与低氧组相比MTT的A值下降 2 9% (P <0 0 5 ) ,[3H]-TdR掺入量下降3 7%。在低氧的PASMC培养液中加入钙通道阻滞剂verapamil也可抑制低氧的促增殖作用 ,与低氧组相比较 ,MTT的A值下降 2 3 % (P <0 0 5 ) ,[3H]-TdR掺入量下降 5 1% (P <0 0 1)。PASMC的低氧培养可使细胞内Ca2 +浓度明显增加 (P <0 0 5 ) ,Sal可抑制低氧所致的细胞内Ca2 +浓度的上升。结论 :红景天甙可抑制低氧促进PASMC增殖、DNA合成的作用 ,其机制可能与抑制低氧时细胞内Ca2 +浓度增加有关。

三种钠尿肽抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖效应的比较

本文比较了心房钠尿肽 (ANP)、C 型钠尿肽 (CNP)、血管钠肽 (VNP)抑制肺动脉平滑肌细胞 (PASMCs)增殖的效应。用蛋白激酶C激动剂佛波酯 (PMA)刺激体外培养大鼠PASMCs的增殖 ,以总蛋白含量和MTT比色OD值为指标 ,观察三种钠尿肽对PMA刺激大鼠PASMCs增殖的影响。结果表明 ,PMA (10 -9～ 10 -7mol/L)显著升高(P <0 0 5 )PASMCs的总蛋白含量和MTTOD值 ,VNP (10 -8～ 10 -6mol/L)、ANP和CNP (10 -7～ 10 -6mol/L)均可显著降低 (P <0 0 5 )PMA (10 -8mol/L)刺激PASMCs的总蛋白含量和MTTOD值。结果提示 :PMA对大鼠肺动脉平滑肌细胞有促增殖作用 ,ANP、CNP、VNP均可抑制PMA刺激大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖 ,VNP的抑制效应最强。

灯盏花素对原代培养的牛肺动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的 研究灯盏花素对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响。方法 用原代培养的小牛肺动脉平滑肌细胞 ,采用MTT比色法、3 H TdR参入法、流式细胞术、Giemsa染色对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响进行观察。结果 与对照组相比 ,灯盏花素处理组可抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖 ,而且主要是细胞周期的G0 /G1到S期受机制。结论 灯盏花素可显著地抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖 。