抑制自噬可以增加mTOR抑制剂AZD8055引起的喉癌细胞株Hep-2的凋亡

目的探讨抑制自噬是否可以增加哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)抑制剂(AZD8055)引起的喉癌细胞株Hep-2的凋亡。方法选用人喉癌细胞株Hep-2细胞系,应用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测m TOR抑制剂AZD8055和(或)自噬抑制剂3-甲基嘌呤(3-MA)对Hep-2细胞活性的影响。Western印迹检测AZD8055和(或)3-MA对Hep-2细胞凋亡通路相关蛋白〔Cleaved多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)、Cleaved Caspase-3、细胞色素C〕的作用。结果 AZD8055作用Hep-2细胞24 h后,细胞生存率显著下降,具有浓度依赖性。AZD8055浓度依赖性地增加Hep-2细胞凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3及细胞色素C表达。当3-MA与AZD8055联用时,二者联用与单用AZD8055组相比,细胞活性显著降低,显著下调凋亡通路相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、细胞色素C表达。结论抑制自噬可以增加m TOR抑制剂AZD8055引起的喉癌细胞株Hep-2的凋亡。

抑制自噬起始阶段增强喜树碱诱导的NCI-H1975人肺腺癌细胞凋亡

目的研究自噬抑制剂氯喹(CQ)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)对喜树碱(CPT)诱导非小细胞肺腺癌NCI-H1975细胞凋亡的影响。方法通过CPT处理肺腺癌NCI-H1975细胞,CCK-8法检测细胞增殖活性,碘化丙啶(PI)染色观察细胞形态学的变化,流式细胞术检测CPT作用于NCI-H1975细胞后细胞的凋亡情况,Western blot法检测自噬及凋亡相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅰ(LC3Ⅰ)和LC3Ⅱ、P62、胱天蛋白酶3(caspase-3)和多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白水平。结果 CPT处理后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例增加;caspase-3和PARP发生明显降解;且这种降解作用能被3-MA增强而被CQ抑制。而且发现CPT处理后,引起细胞内TGF-β1降低。结论抑制NCI-H1975细胞自噬起始阶段后,增强CPT诱导细胞凋亡的敏感性。

基于自噬抑制剂3-MA介导的大叶蛇葡萄总黄酮提取物对人乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨抑制自噬时,大叶蛇葡萄总黄酮提取物(total flavonoid extract,TFE)对人乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法针对人宫颈癌细胞Hela、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞SMMC-7721、人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231及人正常肝细胞L-02,采用MTT法优选敏感细胞株;通过TFE与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)联合运用,采用MTT法检测其对敏感细胞增殖的抑制作用;透射电子显微镜及Hoechst 33258单染法观察细胞的形态学变化;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率的变化;Western blot检测凋亡相关蛋白和通路蛋白(死亡受体途径、线粒体途径、内质网应激途径)的表达水平;免疫荧光法检测线粒体途径关键蛋白Cyt-c表达,并选择自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin,RA)进行反向验证。结果TFE可浓度依赖性抑制人乳腺癌细胞增殖,MCF-7细胞为敏感细胞株,与TFE组相比,TFE+3-MA组在24、48、72 h对MCF-7细胞的抑制率均明显增加(P<0.01),细胞数量减少、间隙增大,凋亡小体增多,凋亡率升高(P<0.01),Bax/Bcl-2(P<0.01)、cleaved caspase-3(P<0.01)、Cyt-c(P<0.05)、FADD、cleaved caspase-12的表达量均升高,核内凋亡蛋白Cyt-c表达增加;TFE+RA组荧光减弱,逆转了TFE诱导的线粒体途径凋亡。结论TFE能明显抑制人乳腺癌细胞的增殖,抑制自噬时可能通过线粒体途径促进MCF-7细胞凋亡,激活自噬可逆转细胞凋亡。

自噬在毛发再生中的作用

背景:在生物医学界,自噬是一个快速发展的研究热点,许多研究人员正在积极探究多种疾病中自噬的分子调控机制,但是自噬在毛发生长中所起的作用仍存在许多未知。目的:综述目前自噬在毛发生长与再生中的研究进展及应用价值,了解自噬在毛发生长中的作用,以探究自噬在病理性脱发中的发病机制,为研究治疗脱发的药物提供新思路。方法:应用计算机在中国知网(CNKI)、PubMed数据库中,以“毛囊生长,毛发生长,毛发再生,自噬相关蛋白,自噬活性,自噬相关基因,自噬”或“hair growth,hair follicle,hair regeneration,autophagy”为检索词进行检索。查阅国内外近年来关于自噬、毛发生长和自噬在毛发生长中作用的研究进展进行总结,排除与文章主题内容不相符的文献,最终纳入78篇文献进行结果分析。结果与结论:(1)自噬是真核生物的正常代谢过程,具有复杂的分子机制和功能特性,既有利于细胞生存,又可促进细胞死亡。(2)脱发相关疾病与自噬活性的改变有关,且自噬活性可调控毛发生长周期;敲除或过表达自噬相关基因可改变毛发生长状态,已发现有多条自噬相关信号通路与毛囊生长有关;自噬的激活剂或抑制剂可用于治疗或预防脱发疾病。

自噬作为多种疾病治疗的靶点

自噬是一种溶酶体降解途径,可降解错误折叠的蛋白质、清除不必要或损伤的细胞器并消除感染的病毒或细菌等病原体,从而维持真核细胞的稳态。自噬对于细胞生存、生物能稳态、机体发育至关重要,与许多人类疾病的发生发展密切相关。本综述总结了自噬在癌症和神经退行性疾病中作用的研究进展,并讨论了靶向自噬的潜在疾病治疗方法。

自噬抑制剂在内质网应激状态下对肝癌HepG2细胞和正常肝细胞L-02作用的差异

目的研究自噬在内质网应激(ERS)状态下对肝癌Hep G2细胞和正常肝细胞L-02作用的差异。方法体外常规培养的人肝癌Hep G2细胞和正常肝细胞L-02,分别给予衣霉素(TM)单药和TM联合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(TM+3-MA)或氯喹(TM+CQ)作用12、24、48 h后,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测自噬蛋白LC3的变化。结果 TM可引起Hep G2细胞和L-02细胞死亡并呈时间依赖关系,3-MA或CQ均可增加TM对Hep G2细胞的生长抑制作用,24 h细胞存活率分别为TM+3-MA组(60%)、TM+CQ组(72%)、TM组(86%),差异有统计学意义(P<0.01);但对于L-02细胞,其存活率分别为83%、84%、83%,活力没有明显差异;流式细胞术显示TM+3-MA、TM+CQ和TM组对Hep G2细胞的凋亡率分别为15%、11%、7%,差异有统计学意义(P<0.01),但对L-02细胞,凋亡率分别为16%、17%、16%,未见明显差异;Western blot法结果显示TM作用引起两种细胞自噬增加,自噬抑制剂3-MA与CQ可引起两种细胞自噬作用减弱。结论自噬抑制剂(3-MA或CQ)均可显著增加TM对肝癌Hep G2细胞的生长抑制作用,但对正常肝细胞L-02的生长抑制作用差异无统计学意义。自噬在ERS状态下可对肝癌细胞的生存提供保护,但对正常肝细胞无保护作用。

核外P53介导的自噬抑制在热打击诱导内皮细胞损伤中的作用

目的观察热打击主动脉内皮细胞(MAEC)后核外p53与细胞自噬和细胞凋亡之间的关系,阐明热打击后细胞死亡模式及其分子机制。方法体外原代分离培养小鼠主动脉内皮原代细胞(MAEC),建立小鼠主动脉内皮细胞热打击模型,对照组将细胞置于标准37℃、5%CO2细胞培养箱,热打击组将细胞置于43℃细胞培养箱中进行热打击2 h,热打击后继续在细胞培养箱进行复温(0、1、3、6、9 h),并分别使用自噬抑制剂3-MA(5 mmol/L),自噬诱导剂rapamycin(20μmol/L),p53抑制剂PFT(10μmol/L)预处理细胞1 h,处理后的细胞通过CCK8法检测细胞活力以及Annexin V-FITC/PI双染色方法检测细胞凋亡率,JC-1染色流式观察细胞线粒体膜电位改变,细胞免疫荧光染色及Western blotting观察p53亚细胞定位和LC3-Ⅱ蛋白表达。结果与对照组(37℃)比较,热打击后(43℃)MAEC细胞活力显著下降(P<0.05);热打击后复温6 h线粒体膜电位明显下降,同时细胞凋亡率显著增高(P<0.05);热打击后随着复温时间(0 h、6 h)延长,胞浆p53表达逐渐减弱,而线粒体p53表达逐渐增强;自噬抑制剂3-MA可进一步诱导细胞线粒体膜电位下降,并显著增高细胞凋亡率,而自噬诱导剂rapamycin可逆转上述损伤作用(P<0.05)。p53抑制剂PFT明显促进了自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达,同时也明显抑制了热打击诱导的细胞线粒体膜电位降低和细胞凋亡(P<0.05)。结论热打击诱导MAEC细胞线粒体损伤及细胞凋亡,其机制与核外p53线粒体移位继而介导细胞自噬抑制有关。

低剂量阿司匹林诱导产生的自噬减弱其对人肝癌HepG2细胞系的抑制作用

目的研究一定浓度的阿司匹林对人肝癌HepG2细胞系的增殖抑制作用及产生抑制作用可能的原因。方法采用MTT法和平板克隆实验研究阿司匹林对人肝癌HepG2细胞增殖活力的影响。吖啶橙荧光染色法观察阿司匹林对人肝癌HepG2细胞内自噬小体的影响。Western blot法检测腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)在人肝癌HepG2细胞中的表达。结果 10 mmol/L浓度的阿司匹林能抑制人肝癌HepG2细胞的增殖活力,但增加HepG2细胞中自噬小体的数量,增加AMPK表达,降低m TOR的表达,且和40μm自噬抑制剂氯喹(CQ)联合使用时,CQ能够增强10 mmol/L浓度阿司匹林对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用。结论联合自噬抑制剂CQ减弱浓度为10 mmol/L的阿司匹林诱导产生的自噬从而明显增强其抗HepG2作用。

抑制自噬对艾塞那肽诱导的AR42J细胞凋亡的影响

目的探讨艾塞那肽对AR42J细胞株的损伤及其可能机制。方法1、5、10pm0I/L艾塞那肽处理AR42J细胞株24、48、72、96、120h,噻唑蓝(Mrrll)法检测细胞活力,筛选最佳浓度和时间作为后续实验条件。设置空白对照组(Nc)、艾塞那肽组(Ex一4)和Ex一4+z—VAD.fmk组,检测艾塞那肽是否可直接导致AR42J细胞凋亡;设置NC组、Ex一4组、3一MA组和Ex-4+3-MA组,探究3一MA能否抑制艾塞那肽诱导的AR42J细胞凋亡。3一MA为自噬抑制剂,z—VAD—fmk为凋亡抑制剂。细胞活力检测采用M1Tr法。流式细胞术检测细胞凋亡率,westemblot检测caspase.3等凋亡相关蛋白以及微管相关蛋白轻链3(Lc3)自噬相关蛋白表达。结果以10pmoL/L艾塞那肽作用72h为后续实验条件。z—VAD—fmk预处理可明显抑制艾塞那肽的细胞毒性,两组细胞活力为(49.4±3.0)%比(81.2±3.3)%,差异有统计学意义(P<0.05)。Ex一4组细胞凋亡率(28.2±1.4)%,高于Nc组的(3.6±0.8)%,差异有统计学意义(P<0.05)。westemblot也显示caspase一3表达明显上调,而z—VAD—fmk预处理则可明显抑制艾塞那肽引起的细胞凋亡和caspase一3表达增加。3-MA预处理可明显抑制艾塞那肽的细胞毒性,处理72h两组细胞活力为(49_8±2.5)%比(79.1±2-3)%,差异有统计学意义(P<O.05)。Ex一4组细胞凋亡率为(29.2±3.2)%,高于Ex一4+3一MA组的(14.5±2.1)%,差异有统计学意义(P<0.05)。westemb10t结果表明艾塞那肽可上调LC3B一Ⅱ、p62和caspase一3的表达,而3一MA预处理则可明显抑制艾塞那肽引起的Lc3B一Ⅱ和caspase一3上调,但p62的表达却进一步上调。结论艾塞那肽可诱导AR42J细胞凋亡,3一MA可通过抑制自噬而抑制艾塞那肽诱导的凋亡。使用3一MA可作为减轻艾塞那肽对胰腺腺泡细胞毒性的一种潜在方法。

自噬抑制剂与乳腺癌治疗的研究现状

自噬是存在于真核生物体内高度保守的过程,能够降解受损蛋白质及细胞器,并回收利用降解产物帮助细胞度过应激状态。自噬在肿瘤的发生发展中具有双重作用。一方面,在肿瘤的起始阶段,自噬通过抑制基因突变及活性氧的产生抑制肿瘤的发生。另一方面,自噬通过促进肿瘤血管生成,清除和循环利用细胞内损伤的蛋白质和细胞器,为肿瘤细胞提供有利的生存条件,而促进肿瘤的发生发展。同时,自噬可能促进肿瘤细胞对放化疗等传统治疗方法的抵抗,导致肿瘤耐药性的产生。最近有研究显示,自噬抑制剂氯喹联合放化疗或内分泌治疗能够有效增强抗癌疗效,这种联合方案有望成为一种新的更有效的治疗乳腺癌的方法。因此,本文就自噬抑制剂氯喹运用于乳腺癌治疗的研究现状进行综述。

PDA介导的温和光热联合自噬抑制剂杀伤乳腺癌细胞

目的探究温和光热条件下,抑制自噬是否增强光热治疗的敏感度。方法采用改良的双乳化法和基于聚多巴胺(polydopamine,PDA)的表面修饰法制备CQ@PLGA@PDA NPs;对其进行基本表征后,CCK-8法检测纳米粒子的细胞毒性;近红外激光照射纳米粒子溶液检测升温效果;CCK-8法和活-死细胞染色检测其光热杀伤肿瘤细胞效果;蛋白质免疫印迹实验检测自噬相关蛋白的表达。结果成功制备了CQ@PLGA@PDA NPs,其粒径为253.10±2.39 nm,Zeta电位为-22.57±0.80 mV,粒径均一,分散性好;近红外激光(NIR)辐照纳米粒子溶液10 min后,温度升高至45℃;CQ@PLGA@PDA NPs对细胞无明显毒性,乳腺癌细胞MDA-MB-231和小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3细胞的存活率均在为95%以上;细胞治疗和蛋白质免疫印迹结果表明,温和光热条件下,抑制自噬可以提高光热治疗的敏感度。结论CQ@PLGA@PDA NPs光热性能好,生物安全性高;通过抑制细胞自噬,可以在温和的光热条件下(<50℃)有效杀伤乳腺肿瘤细胞。

自噬在血管性痴呆发病中的作用研究

目的研究自噬在血管性痴呆(VD)发病中的作用及自噬抑制剂对其的影响。方法 180只SD大鼠随机分为假手术组、VD组和自噬抑制剂干预组(自噬抑制剂组),每组又分为术后1、2、4、8、12周亚组。采用四血管阻断法制作VD大鼠模型,自噬抑制剂组大鼠在术前1 h给予渥曼青霉素0.5 mg/kg腹腔注射。用Morris水迷宫试验检测大鼠的学习记忆能力;免疫组化SP法检测大鼠海马CA1区自噬相关蛋白Beclin-1、Cathepsin B的表达,Western-blotting法检测自噬活性微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ与Ⅰ的比值。结果与假手术组比较,VD组和自噬抑制剂组各亚组大鼠的学习、记忆能力明显降低;海马CA1区Beclin-1、Cathepsin B蛋白表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高(P<0.05～0.01),并均以术后第4周为最高。而自噬抑制剂组各亚组大鼠的学习、记忆能力明显好于,海马CA1区Beclin-1、Cathepsin B蛋白表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显低于VD组(P<0.05～0.01)。结论 VD大鼠的认知功能减退,海马自噬相关蛋白表达及自噬活性明显增高;自噬抑制剂对其有改善及抑制的效果。自噬在VD发病中起了重要的作用。

自噬与肿瘤防治新策略

自噬是细胞清除并回收利用错误折叠的蛋白及受损细胞器而维持细胞稳态的分解代谢过程。这一过程与包括肿瘤在内的许多疾病有密切的关联,现已成为癌症研究的热点。自噬既具有肿瘤抑制功能,在化疗中又能保护肿瘤细胞。近年来,在自噬相关蛋白中,对自噬形成起到关键作用的液泡分选蛋白34(VPS34)受到了广泛关注,已和自噬一起成为肿瘤防治和抗肿瘤药物筛选靶标。最近,3个VPS34的特异性抑制剂PIK-Ⅲ,VPS34-IN1和SAR405相继面世,它们可能对自噬的抑制及肿瘤干预具有独特的影响。本文介绍了自噬在肿瘤中扮演的不同角色和VPS34在自噬中的功能调控,还讨论了以自噬及VPS34为靶标的抑制剂研究最新进展及其在肿瘤防治中的应用前景。

自噬机制在肿瘤化疗中的研究进展

自噬是一把双刃剑:一方面过度的自噬可诱导自噬性细胞死亡,另一方面自噬对肿瘤细胞有保护作用,通过将自身坏死的细胞器和错误折叠的蛋白质降解,重新利用养分维持癌细胞生存,造成了对化疗药物的耐受,自噬抑制剂可增加肿瘤对化疗药物的敏感性,因此,抑制自噬联合化疗药物治疗将在肿瘤的治疗方面有很大的前景。

自噬在肝脏疾病中的作用研究进展

自噬是将细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解的细胞自我消化过程。自噬普遍存在于机体细胞中,往往在营养缺乏、低氧等特定环境以及细胞内应激(损伤的细胞器、细胞内突变的蛋白、微生物入侵等)状态下发生。近年来研究发现,自噬在许多肝脏疾病的发生、发展中起重要作用,该文就相关研究进展予以综述。

细胞自噬研究方法的比较与分析

自噬是一种在真核细胞内保守的降解过程,从单细胞的酵母到哺乳动物中都普遍存在。自噬通过降解细胞内受损的蛋白、细胞器、细胞质以及入侵的微生物等来维持机体的稳态。结合已有的文献报道和实验室的经验积累,总结了目前在细胞自噬研究中常用的一些研究方法:LC3 turnover、GFP的抗降解性、p62、mRFP-GFP-LC3活细胞成像、电镜和流式细胞仪检测等,以及在实验中需要注意的具体事项,如一些可以直接影响实验结果但并没有引起人们重视的因素。希望能为新进入细胞自噬领域的研究人员提供一些实验操作上的指导和参考,从而可以在自噬研究中得到真实准确及可重复的实验结果与合理的理论解释。

自噬在急性脑损伤的研究进展

半个世纪以前，比利时细胞学家Christian de Duve用自噬这一术语来描述细胞利用溶酶体来消化胞浆成分这一过程。依据待降解产物运送到溶酶体时的形态不同，自噬主要可以分为三类：①大自噬，其特征是形成独特的双层膜细胞器．自噬小体，这是一种通过自噬小体与溶酶体融合的途径并在细胞稳态中起着重要作用；②小自噬，溶酶体器膜将胞浆成分直接内吞进去；③分子伴侣介导的自噬，是由分子伴侣热休克蛋白70、溶酶体相关的膜蛋白2A介导的降解过程。

自噬调节在白血病治疗中的潜在意义

自噬是一种真核细胞中的分解代谢过程,通过溶酶体的作用分解受损的细胞器和蛋白质,在营养缺乏和应激时,为细胞的代谢提供原料和能量。随着自噬的关键调控机制及其在生理过程中的作用逐渐明确,人们越来越多的认识到自噬在人类疾病（包括癌症）中的重要作用。

多种细胞自噬调节剂对自噬标记物LC3Ⅱ及p62表达的影响

利用Western杂交检测自噬标记物LC3Ⅱ和p62的表达是评价细胞自噬活性的常用方法。为了比较作用于不同靶点的细胞自噬调节剂对LC3Ⅱ和p62表达的影响,分别利用以mTOR依赖或非依赖方式活化细胞自噬的雷帕霉素或海藻糖、抑制自噬起始的3-甲基腺嘌呤、抑制自噬小体与溶酶体融合的巴弗洛霉素A1以及抑制溶酶体酶活性的E64d和pepstatin A处理HEK293细胞,通过Western杂交检测LC3Ⅱ和p62的表达。结果显示,雷帕霉素增强LC3I向LC3Ⅱ转化,促进p62降解,而海藻糖仅引起LC3Ⅱ表达的上调;阻断细胞自噬过程各个阶段均导致LC3Ⅱ和p62堆积,并呈现出剂量和时间依赖性。这些结果提示尽管LC3Ⅱ和p62均为自噬标记物,但不同的调节剂对其表达的调控存在差异。

自噬在肿瘤治疗中的研究进展

虽然尚难定论自噬究竟引起细胞死亡还是维持生存,但是越来越多的报道表明,在接受放射性治疗或化学药物治疗后,自噬能促进肿瘤细胞生长[1-4]。而给予自噬抑制剂如3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine）、氯喹（chloroquine）,或者敲降自噬相关基因如Atg-7、Beclin1,可以使在化疗或放疗中产生抵抗的数种肿瘤重获敏感性。