半胱氨酸双加氧酶1基因启动子甲基化在肿瘤研究中的应用

半胱氨酸双加氧酶1(cysteine dioxygenase 1,CDO1)是一种肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene,TSG),参与细胞增殖、分化、凋亡及铁死亡等一系列生理过程。DNA甲基化是人类肿瘤中表观遗传学修饰的主要方式之一,CDO1是一种与恶性肿瘤高度相关的甲基化基因(highly relevant methylation gene,HRMG),在多种人类癌症中被其甲基化启动子所沉默,甲基化的CDO1基因启动子是人类肿瘤中最常见的早期特异性诊断标志物之一。本文就CDO1生物学功能及其启动子DNA的甲基化在肿瘤中的作用及调控作一综述。

吸烟导致的芳香烃受体抑制因子基因低甲基化与冠心病患者死亡风险的相关性

目的通过检测冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)患者芳香烃受体抑制因子(aryl-hydrocarbon receptor repressor,AHRR)(cg05575921)甲基化水平,探究AHRR基因甲基化水平与吸烟、冠心病患者心血管危险因素及死亡之间的关系。方法于2010至2013年在广东省人民医院心内科入选冠心病患者,172例死亡患者作为死亡组,209例非死亡患者作为对照组。建立焦磷酸测序法检测AHRR(cg05575921)的甲基化水平,验证吸烟与AHRR(cg05575921)甲基化水平的关系,采用线性回归分析对AHRR(cg05575921)甲基化与心肌酶、血脂和心功能的相关性进行分析,采用Logistic回归分析对AHRR(cg05575921)甲基化水平与冠心病患者全因性死亡的相关性进行分析。结果吸烟患者AHRR(cg05575921)甲基化水平显著低于戒烟患者和不吸烟患者,差异有统计学意义(P<0.0001);戒烟患者AHRR(cg05575921)甲基化水平低于不吸烟患者,差异有统计学意义(P=0.0027)。AHRR(cg05575921)甲基化水平与心肌损伤标志物[丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酸激酶同工酶(CKMB)、乳酸脱氢酶(LDH)和α-羟丁酸脱氢酶(HBDH)]和左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolicdiameter,LVESD)呈显著负相关(P<0.005),与左心室射血分数呈显著正相关(P<0.005)。死亡患者AHRR(cg05575921)甲基化水平显著低于非死亡患者(0.6963±0.0088 vs.0.7224±0.0081,P=0.0064)。校正潜在混杂因素之后,AHRR(cg05575921)甲基化水平与死亡呈显著的负相关(OR=0.046,95%CI:0.0028~0.48965,P=0.0441)。结论吸烟导致AHRR(cg05575921)低甲基化,可能引起冠心病患者的心肌损伤指标升高并且影响心功能,从而增加冠心病患者死亡风险。

TSHR基因甲基化与PTC的关系研究

甲状腺癌是头颈部较为常见的恶性肿瘤,发病率在全球范围内呈上升趋势,病理类型以甲状腺乳头状癌(Papillary Thyroid Carcinoma, PTC)最为常见。促甲状腺激素受体(Thyroid Stimulating Hormone Receptor, TSHR)是甲状腺特异蛋白,促甲状腺激素受体基因是PTC的抑癌基因,其编码基因启动子高甲基化会引起TSHR功能异常,从而影响甲状腺功能改变,导致甲状腺疾病发生。研究表明,TSHR基因启动子高甲基化可能与PTC发病机制密切相关。现就TSHR编码基因甲基化在PTC中的研究予以综述。

白血病细胞雄激素受体基因启动子甲基化状态的研究

目的检测白血病细胞雄激素受体基因启动子区CpG岛甲基化状态情况,初步探讨雄激素受体基因启动子区甲基化与白血病发病机制的可能联系。方法应用甲基化特异性PCR技术(methylation specific PCR,MSP)检测3种白血病细胞株及15例患者骨髓标本雄激素受体基因甲基化状态。结果白血病细胞株均出现甲基化和非甲基化带,呈部分甲基化状态,而作为对照的正常人白细胞均只出现非甲基化带。15例白血病患者全部检出甲基化状态。结论白血病细胞的雄激素受体基因启动子区存在高甲基化现象,可能为白血病的致病机制分析提供了一个新的方向,提示AR基因启动子CPG岛的甲基化有可能成为白血病的新的参考标记物。

甲基化抑制剂5-aza-2′-deoxycytidine对K562细胞SHP-1基因表达及细胞增殖与凋亡的影响

本研究探讨5-氮杂胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine,5-aza-CdR)对K562细胞中抑癌基因SHP-1的转录调控作用及对K562细胞增殖凋亡的生物学影响,为寻找肿瘤治疗新靶点提供实验依据。采用MSP方法检测SHP-1基因甲基化状态,MTT法检测不同剂量(0.5,1,2μmol/L)5-aza-CdR作用K562细胞1,3,5天时对K562细胞存活率的影响,流式细胞术(FCM)分析5-aza-CdR作用1,3,5天时细胞周期及凋亡率的变化,实时定量PCR(FQ-PCR)和Westernblot方法检测5-aza-CdR处理前后SHP-1mRNA及蛋白表达水平、p-STAT5蛋白表达变化。结果表明,K562细胞中存在SHP-1基因的甲基化,5-aza-CdR作用使K562细胞中SHP-1mRNA和蛋白重新表达,而p-JAK2蛋白表达随之呈下降趋势;5-aza-CdR明显抑制K562细胞增殖,并与药物浓度及作用时间呈正相关。JAK2特异性抑制剂AG490明显抑制K562细胞增殖;5-aza-CdR可使K562细胞凋亡率增加,且作用也呈时间依赖性,用药1,3,5天细胞凋亡率分别为9.3%,24.2%,37.7%。2μmol/L的5-aza-CdR处理24小时后,G0/G1期细胞逐渐增多,G2/M期细胞逐渐减少,细胞阻滞在G0/G1期。5-aza-CdR作用1,3,5天时G2/M期细胞比例分别为30.7%,23.4%,19.3%。结论:特异性甲基化转移酶抑制剂5-aza-CdR能使K562细胞中沉默的SHP-1基因重新表达,并可能通过JAK/STAT路径活化抑制白血病细胞增殖并诱导其凋亡。

重亚硫酸氢盐测序法检测Wnt信号通路抑制基因在急性早幼粒细胞白血病细胞中甲基化变化

目的:应用重亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测急性早幼粒细胞白血病细胞株(NB4)Wnt信号通路抑制基因启动子区CPG岛的甲基化状态,筛选NB4细胞中高甲基化的Wnt信号通路抑制基因,并探讨BSP法作为定量研究基因甲基化方法的优缺点。方法:以NB4细胞为研究对象,20例健康人单个核细胞为对照;常规提取DNA并用亚硫酸氢盐处理,然后用PCR扩增目标序列,应用重亚硫酸氢盐测序法(BSP)分析在NB4细胞中Wnt信号通路抑制基因基因的甲基化状态。并通过与甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,M SP)、焦磷酸测序技术(pyrosequencing)比较、评价BSP法检测NB4细胞Wnt信号通路抑制基因甲基化状态的优缺点。结果:BSP产物克隆测序检测NB4细胞Wnt信号通路抑制基因甲基化发生率分别为:WIF-1基因95.26%,DKK3基因86%,SFRP1基因81.67%,SFRP2基因95.71%,SFRP4基因85%,SFRP5基因95%;20例健康人单个核细胞为对照组中Wnt信号通路抑制基因甲基化发生率分别为:WIF-1基因1.5%,DKK3基因4.2%,SFRP1基因0%,SFRP2基因0.9%,SFRP4基因2.5%,SFRP5基因1.75%。与正常人M NC相比,NB4细胞的Wnt信号通路相关抑制基因启动子甲基化率明显增高。结论:急性早幼粒细胞株NB4细胞中存在Wnt信号通路多个抑制基因高甲基化状态。此类基因异常甲基化有可能成为急性早幼粒细胞白血病的早期诊断指标和治疗靶点。

乳腺癌C-erbB-2基因启动子区CpG岛的甲基化状态与雄激素受体表达的相关性分析

目的探讨乳腺癌中雄激素受体(AR)与人表皮生长因子受体2(C-erbB-2)基因启动子区CpG岛甲基化状态的关系,并明确AR与乳腺癌预后的关系。方法分别采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和免疫组织化学(IHC)方法分析76例乳腺癌患者癌组织和55例乳腺良性肿瘤患者肿瘤组织C-erbB-2基因启动子区CpG岛的甲基化状态和AR的表达水平,结合临床病理资料分析AR不同表达状态与C-erbB-2基因启动子区CpG岛甲基化水平的关系,并进行预后分析。结果 AR阳性的乳腺癌组织C-erbB-2基因启动子区CpG岛甲基化的比例[74.58%(44/59)]显著高于AR阴性的乳腺癌组织[47.06%(8/17),P=0.032];C-erbB-2基因启动子区CpG岛的甲基化与AR蛋白的表达呈正相关(r=0.247,P=0.032),且乳腺癌AR阳性患者无瘤生存率显著高于AR阴性患者(P<0.05)。结论乳腺癌组织AR蛋白的表达状态可作为乳腺癌预后转归的预测依据之一;C-erbB-2基因启动子区CpG岛的甲基化与AR蛋白的表达状态呈正相关,为乳腺癌的激素治疗及预后转归的预测提供了新的理论依据。

前列腺癌中E-钙粘素、p16及雌激素受体基因甲基化的检测及其临床意义

目的:研究前列腺病变中E-钙粘素、p16和雌激素受体(ER)基因启动子CpG岛甲基化状况及其与临床资料的关系,探讨基因过甲基化在前列腺癌(PCa)发生发展中的作用及其临床意义。方法:收集石蜡包埋前列腺全切术标本:良性前列腺增生(BPH)13例,高级别前列腺上皮内瘤(HGPIN)10例,有随访记录的PCa 20例。采用甲基化特异性PCR(MSP)技术对E-钙粘素、p16和ER基因CpG岛甲基化进行检测。结果:E-钙粘素、p16和ER基因过甲基化在PCa中的发生率分别为30%、25%和65%。非恶性病变(BPH和HGPIN)很少发生DNA过甲基化。结论:PCa的发生及进展与E-钙粘素、p16和ER基因过甲基化密切相关,检测甲基化状况对HGPIN与PCa的鉴别诊断可能有辅助作用。E-钙粘素和ER基因过甲基化可能提示预后差。

肿瘤抑制基因DNA甲基化与宫颈癌研究进展

子宫颈癌居女性恶性肿瘤发病率第二位,严重威胁着女性的生命和健康。实验发现,表观遗传学改变与人类多种肿瘤有着密切的关系,而肿瘤抑制基因DNA甲基化则是宫颈癌中常见的表观遗传学现象,与宫颈癌发生发展有着密不可分的联系。肿瘤抑制基因DNA甲基化研究将为宫颈癌发生机制研究,宫颈癌筛查及治疗提供新思路。

雌激素受体α基因甲基化与缺血性卒中的相关性研究

目的 DNA甲基化作为一种主要的表观遗传修饰模式,与许多疾病的发生及发展相关。而关于缺血性卒中病人基因甲基化方面的研究较少。本研究主要探讨人雌激素受体α(ER-α)基因启动子区甲基化状态与缺血性卒中的相关性。方法入选83例缺血性卒中患者和94例对照者,所有患者记录梗死灶大小,行NIHSS评分及Barthel指数评定。行颈动脉彩色超声及颅脑磁共振血管造影的患者,计算Crouse积分及斑块指数,评估颅内动脉硬化程度。所有研究对象均抽取清晨空腹静脉血,采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测静脉血ER-α基因启动子区甲基化状态。结果缺血性卒中组ER-α基因启动子区甲基化检出率较对照组升高(42.2%比19.1%,P<0.05)。有52例患者行颈动脉彩色超声检查,完全甲基化组、部分甲基化组及非甲基化组间颈动脉内膜中膜厚度、Crouse积分及斑块指数存在差异(P<0.05)。有57例患者行颅脑磁共振血管造影检查,非动脉硬化组、动脉硬化组、动脉狭窄组及动脉闭塞组甲基化检出率有升高趋势(分别为40.9%、42.9%、52.4%、57.1%),但差异无统计学意义(P>0.05)。根据梗死灶大小分为小梗死组、中等梗死组和大梗死组,甲基化检出率依次增高(分别为32.8%、56.3%、77.8%),差异有统计学意义(P<0.05)。完全甲基化组、部分甲基化组及非甲基化组间NIHSS评分和Barthel指数存在差异(P<0.05)。结论缺血性卒中患者ER-α基因启动子区甲基化程度较对照组升高,其与颈动脉硬化程度、梗死灶大小、神经功能缺损严重程度等相关。

卵巢癌细胞卡铂耐药相关肿瘤抑制基因的表达变化及其启动子区甲基化观察

目的观察卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因的表达变化及其启动子区甲基化状态。方法应用分子生物信息学方法,从卵巢癌卡铂耐药基因表达谱芯片中筛选13个肿瘤抑制基因(VHL、COPS2、NOL7、GGNBP2、RBL1、S100A2、PARG1、PERP、TCF3、DNAJA3、ING1、RARRES3、RBBP8),并采用RT-PCR法检测这些基因在卵巢癌卡铂耐药细胞系(SKOV3-CB)及其亲本细胞系(SKOV3)的表达;分析肿瘤抑制基因启动子区CPG岛并设计出8个基因(VHL、COPS2、NOL7、RBL1、PARG1、PERP、DNAJA3)的引物,采用甲基化特异性PCR法检测SKOV3-CB、SK-OV3细胞8个基因启动子区甲基化状态。结果与SKOV3相比,除GGNBP2基因外,其余12个基因均在SKOV3-CB中表达下调。SKOV3-CB、SKOV3的ING1、DNAJA3、VHL甲基化引物均能够扩增出产物,未甲基化引物均不能扩增出产物;COPS2、PERP甲基化引物均不能够扩增出产物,未甲基化引物均能够扩增出产物;PARG1、NOL7、RBL1甲基化引物与未甲基化引物均能够扩增出产物。结论卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达下调,其启动子区无甲基化;甲基化机制与卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因的表达下调无关。

甲基化特异PCR 方法对p16肿瘤抑制基因的研究

目的：研究肺癌、结肠癌组织中 p16 肿瘤抑制基因甲基化状态及其临床意义。方法：采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法，特异扩增分析甲基化和非甲基化两种状态。结果：p16基因在人胚肺组织处于非甲基化状态；在人肺巨细胞癌细胞系（PLA801-D)呈甲基化状态；在检测的肿瘤标本中，60％ 肺癌组织及 70％ 结肠癌组织出现甲基化状态。结论：p16 基因的甲基化状态是肺癌、结肠癌组织中 p16 基因异常形式之一，有可能成为肿瘤分子诊断的重要标志，MSP 方法有临床普及应用前景。

雄激素受体基因甲基化与食管癌的分级

目的研究食管癌组织中雄性激素受体(AR)基因的5’端CpG岛的甲基化状态及其与食管癌分级的关系,探讨其与肿瘤生物学特性的相关性。方法应用限制性内切酶(HpaII,MspI和HhaI)和PCR扩增方法,对48例食管癌组织和34例癌旁组织AR的5’端CpG岛的甲基化状态分析,并进行不同级别间的比较及统计学分析。结果48例食管癌组织中HhaI位点甲基化占45.8%,HpaII位点甲基化占56.3%;34例癌旁组织中HhaI位点甲基化占61.8%,HpaII位点甲基化占58.8%,男性不同级别癌组织的甲基化程度均比癌旁组织低,随着级别的上升癌及癌旁组织甲基化程度也随着上升;对28例同一个体的癌及癌旁组织研究发现发生甲基化改变的占39.3%,其中程度降低占72.7%,均为男性。结论雄性激素受体基因去甲基化可能是食管癌发生发展的重要始动因素之一,为进一步研究采用抗雄性激素防治食管癌提供了实验依据。

DNA甲基化酶抑制剂对鸡脂肪发育相关基因表达的影响

为了研究DNA甲基化在调控脂肪生长发育中的作用,试验采用甲基化酶抑制剂(5-azadc)处理鸡原代前脂肪细胞,采用Real-time RT-PCR方法分析鸡脂肪生长发育相关基因(PPAR长、C/EBPB、HOPX、KLF7、A-FABP)的表达变化。结果表明:甲基化酶抑制剂处理均不同程度地提高了PPAR抑、C/EBPB、HOPX、KLF7、A-FABP基因的表达。农业部鸡遗传育种重点实验室前期研究结果也发现,高、低脂肉鸡腹部脂肪组织的DNA甲基化水平存在差异,提示DNA甲基化参与鸡脂肪组织生长发育的调控。

β1肾上腺素能受体基因多态性及其甲基化修饰对美托洛尔降压疗效的影响

目的研究β1肾上腺素能受体基因多态性及其甲基化修饰对美托洛尔降压疗效的影响。方法入选300例高血压病患者,给予相同剂量美托洛尔降压治疗,同时用聚合酶链反应限制片长多态性法检测其基因型,比较不同基因型高血压患者血压下降水平;用甲基化特异性聚合酶链反应法检测相同基因型高血压患者和正常血压者β1肾上腺素能受体基因甲基化修饰情况。结果美托洛尔治疗后,Arg389Arg型患者舒张压较Gly389Arg型和Gly389Gly型患者明显下降(降幅8.0%±1.3%比4.0%±1.5%和3.0%±1.1%,P<0.05);三种基因型患者收缩压下降幅度差异无显著性。所有研究对象外周血中β1肾上腺素能受体基因均存在甲基化修饰。结论β1肾上腺素能受体的Gly389Arg基因多态性与美托洛尔降压疗效相关;外周血β1肾上腺素能受体基因甲基化修饰未发现与美托洛尔降压疗效相关。

二甲基亚硝胺肝纤维化过程中金属蛋白酶组织抑制因子1基因表达的动态变化

目的 观察肝纤维化过程中TIMP -1基因表达的动态变化 ,探讨肝纤维化的发生发展机理 ,以及中药复方 86 1的抗纤维化机制。方法 10 0只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组和复方 86 1预防组。模型组用二甲基亚硝胺 (DMN)腹腔内注射诱导大鼠发生肝纤维化 ,共计 6周 ,第 1周注射 3次 ,其它周均注射 2次 ,观察 8周 ;复方 86 1预防组大鼠则在用DMN腹腔注射的同时 ,每天接受中药灌胃 1次 ,直至实验结束 ;正常对照组以生理盐水代替DMN腹腔内注射。分别于第 1、 4、 10、 17、 2 8、 42、 5 6天分批处死动物 ,取出肝脏 ,以半定量RT -PCR法检测肝组织中TIMP -1mRNA。结果 从动态发展来看 ,正常对照组大鼠肝组织TIMP -1mRNA的表达水平基本稳定不变 ;模型组大鼠肝组织TIMP -1mRNA的表达从第 4天开始升高 ,10天后一直维持高水平表达直至动物实验结束 ;复方86 1预防组TIMP -1mRNA的表达变化不大。从组间比较来看 ,模型组肝组织TIMP -1mRNA的表达水平从第 4天开始即比正常对照组明显增高 ,此后升高更显著直至实验结束 ;86 1预防组从第 10天开始比正常对照组有所增高 ,但比模型组明显低 ,从 2 8天开始以后则比模型组降低越发显著。结论 TIMP -1的表达在肝纤维化的发展过程中逐渐增高。它能抑制纤维胶原降解 ,因?

启动子CpGs位点甲基化所致BRCA1基因转录抑制作用的位点特异性

目的 研究 BRCA1基因 Cp G岛内各个 Cp Gs位点甲基化与转录水平的关系 ,探讨甲基化所致转录抑制作用的特异性 Cp G位点 ,以阐明 DNA甲基化的作用方式。方法 以 Rice等研究数据为材料 ,用方差分析和多因素线性回归模型等方法进行统计再分析。结果 BRCA1基因 Cp G岛 +8～ +44、- 189～ - 19、- 379～ - 2 5 8、- 37～ - 19和 - 80～ - 19区段内 Cp Gs的甲基化与基因转录抑制有关 ,这些区段内 Cp Gs位点的甲基化数目越多 ,基因转录水平越低。多因素线性回归模型分析表明 ,- 80～ - 19区段的甲基化与转录抑制关系密切。并以 - 2 9Cp G位点甲基化引起的转录抑制作用最强。结论 Cp G岛甲基化引起的转录抑制与 Cp Gs位点有关 ,具有位点的特异性。

肿瘤抑制基因甲基化与胃癌

目的探讨肿瘤抑制基因甲基化与胃癌的关系。方法对近年来关于肿瘤抑制基因甲基化与胃癌关系的文献进行综述分析。结果胃癌中,细胞周期调控基因、有丝分裂检测点基因、凋亡相关基因、错配修复基因、转移相关基因等多种肿瘤抑制基因发生甲基化而失活。结论肿瘤抑制基因甲基化在胃癌的发生、发展过程中起重要作用,肿瘤抑制基因的甲基化有可能成为胃癌诊断、判断转移和评价预后的分子标记物,去甲基化干预有望成为胃癌治疗的新方法。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人胃癌SGC-7901细胞株生长及EDNRB基因启动子异常甲基化的影响

目的:探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人胃癌细胞系SGC-7901细胞株的生长及EDNRB基因启动子异常甲基化的影响.方法:使用1、2、5、10μmol/L5-Aza-CdR干预胃癌SGC-7901细胞,甲基化特异性PCR(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测药物干预前后EDNRB基因的甲基化状态和EDNRB mRNA的表达,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡的改变.结果:未经5-Aza-CdR处理的SGC-7901细胞中EDNRB基因启动子区域CpG岛高甲基化,且EDNRB mRNA不表达,经1、2、5、10μmol/L5-Aza-CdR处理4d后,EDNRB基因启动子区域高甲基化状态得到逆转,细胞中EDNRB mRNA表达恢复.4种浓度5-Aza-CdR处理的SGC-7901细胞后,细胞增殖受到抑制,且呈时间和剂量依赖性;并抑制SGC-7901细胞生长周期,其细胞周期阻滞于S期,5、10μmol/L5-Aza-CdR实验组细胞凋亡率显著高于对照组,且差异有统计学意义(7.13%±0.87%,13.34%±1.12% vs 3.69%±0.52%,P=0.032,P<0.001).结论:5-Aza-CdR能有效逆转人胃癌SGC-7901细胞EDNRB基因的异常甲基化,从而激活因高甲基化导致EDNRB基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,抑制该细胞的生长.