小鼠microRNA-21慢病毒抑制载体的构建及鉴定

目的构建microRNA-21(miR-21)慢病毒抑制载体,为研究miR-21在小鼠体内的功能及作用机制打下基础。方法利用miR-21前体并将其克隆入LV3pGLV-H1-GFP质粒中,经酶切及测序鉴定,利用脂质体将鉴定的阳性重组LV3pGLV-H1-GFP-miR-21抑制载体、PG-P1-VSVG和pCMV-dR3个质粒转染到HEK-293T细胞,将所得病毒感染293T细胞,检测病毒滴度,并将制备的病毒颗粒感染乳鼠心肌细胞和尾静脉注射小鼠,检测miR-21在小鼠体内的表达。结果酶切及测序结果证明成功构建了LV3pGLV-H1-GFP-miR-21重组质粒,并成功包装成慢病毒,病毒滴度为2.4×109TU/ml,重组病毒成功感染心肌细胞,同时在Balb/c小鼠心脏有表达。结论成功构建miR-21慢病毒抑制载体,获得高效表达miR-21的慢病毒颗粒,为miR-21的进一步研究奠定了基础。

人类microRNA-1246慢病毒抑制载体的构建以及鉴定

目的:构建microRNA-1246慢病毒抑制载。方法针对microRNA-1246成熟体的反义核苷酸片段,应用基因重组技术将目的基因片段克隆到GV280慢病毒载体中,通过酶切、PCR、DNA测序验证重组克隆的成功构建,将GV280-mir-1246down、Helper1.0、Helper2.0共转染293T细胞获得重组慢病毒,浓缩提纯病毒液并检测病毒滴度,用病毒液感染siha细胞,通过检测绿色荧光蛋白(GFP)验证GV280-mir-1246down在siha细胞的表达情况,用嘌呤霉素筛选GV280-mir-1246down稳转细胞株。用细胞计数的方法检测细胞的生长率。结果①对菌落进行PCR鉴定筛选出构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确;②GV280-mir-1246down、Helper1.0、Helper2.0共转染293T细胞产生重组慢病毒;③目的mir-246down被慢病毒成功导入siha细胞中,同时达到稳定表达,转到率几乎达100%,荧光显微镜下能直接观察到GFP;④细胞计数结果显示在siha细胞中microRNA-1246的下调细胞的生长速度减弱。结论成功构建microRNA-1246慢病毒抑制载体,建立siha细胞mir-1246-down的稳转株,microRNA-1246在siha细胞中下调的siha细胞的增殖能力下降.这为研究microRNA-1246在宫颈鳞癌siha细胞的作用及其机制提供了可靠的基础。

人类微小RNA-1246慢病毒抑制载体的构建及对宫颈鳞癌细胞增殖和侵袭的影响

目的构建并鉴定微小RNA(miRNA)-1246慢病毒抑制载体,并探讨miRNA-1246下调对宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响。方法针对miRNA-1246成熟体的反义核苷酸片段设计引物并合成目的基因miRNA-1246-down,应用基因重组技术将目的基因克隆到空载质粒GV280中,通过酶切、PCR、DNA测序验证重组慢病毒质粒(GV280-miRNA-1246-down)的构建是否成功,将GV280-miRNA-1246-down、Helper 1.0、Helper 2.0共转染293T细胞获得重组慢病毒,浓缩提纯病毒液并检测病毒滴度,再用重组病毒液感染宫颈鳞癌细胞Si Ha,通过检测绿色荧光蛋白(GFP)验证GV280-miRNA-1246-down在Si Ha细胞的表达情况,用嘌呤霉素筛选GV280-miRNA-1246-down稳转细胞株。将Si Ha细胞分为空白组(NC组)、阴性病毒组(NC-LV组)、miRNA-1246下调组(miRNA-1246-down-LV组),用细胞计数的方法检测细胞的生长率,用Transwell检测细胞侵袭能力。结果 (1)对菌落进行PCR鉴定筛选构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确。(2)慢病毒将目的基因miRNA-1246-down成功导入Si Ha细胞中,同时达到稳定表达,转染率达90%以上,在荧光显微镜下能直接观察到GFP。(3)miRNA-1246-down-LV组Si Ha细胞增殖数低于其他两组(P<0.05),细胞穿膜次数较其他两组减少(P<0.05)。结论 miRNA-1246慢病毒抑制载体构建成功,miRNA-1246稳定下调的Si Ha细胞株建立成功。在Si Ha细胞中miRNA-1246下调可抑制宫颈鳞癌Si Ha细胞的增殖以及侵袭能力。

小鼠microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体的构建及鉴定

目的构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体。方法设计针对microRNA-150前体的过表达基因片段及针对microRNA-150成熟体的反义片段,应用基因重组技术将目的基因片段克隆到pWPI慢病毒载体中,并进行DNA测序鉴定重组克隆。结果菌落PCR筛选鉴定出构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确。结论成功构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体,为研究microRNA-150在肝再生中的作用及其机制提供了稳定的细胞转染载体。

肿瘤抑制因子p53/溶质载体家族7成员11蛋白调控铁死亡在缺血性脑卒中疾病中的研究进展

缺血性脑卒中是中老年人致残及死亡的主要原因,完善脑卒中的治疗方案并改善患者的生活质量已然成为当今医学研究的热点。铁死亡是最新研究发现的细胞程序性死亡,对脑缺血-再灌注的发病机制有重要的调控作用,肿瘤抑制因子p53(Tumor Suppressor Protein p53,P53)/溶质载体家族7成员11蛋白(Solute Carrier Family 7 Member 11,SLC7A11)是铁死亡过程中的重要信号传导通路,与缺血性脑卒中的生理病理息息相关,但目前关于此通路作用于缺血性脑卒中的机制仍需更多的循证医学证据。中药作为公认的多靶点治疗手段,是治疗缺血性脑卒中细胞铁死亡的一种手段,也对P53/SLC7A11信号传导通路发挥了关键的调控作用。但目前铁死亡参与缺血性脑卒中的作用机制未完全阐明,中药如何调控铁死亡相关信号通路尚处于探索阶段,随着相关研究的深入,中药作用于铁死亡信号通路的机制会更加清晰,中药复合提取物与中药活性物质可能是缺血性脑卒中铁死亡未来的研究方向和治疗前景。目前P53/SLC7A11信号传导通路研究以基础研究为主,随着研究的进展,应将基础研究与临床研究相结合,以期开展新药研发,为缺血性脑卒中提供新的治疗手段和途径。文章对P53/SLC7A11信号传导通路在缺血性脑卒中疾病中的调控过程以及中药对此信号传导通路所产生的效力进行综合性叙述,以期为缺血性脑卒中的临床治疗及预防提供新的策略。

新型抗菌剂:脂烯酰基酰基载体蛋白还原酶抑制剂的研究进展

简介脂烯酰基酰基载体蛋白还原酶在脂肪酸生物合成中的催化作用,综述其5类抑制剂即1,4-二取代咪唑类、2,9-二取代-1,2,3,4-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚类、氨基吡啶类、吲哚萘啶酮类及3-氰基-4,6-二取代-2-吡啶硫醚类化合物的抗菌作用机制和构效关系。脂肪酸合成途径Ⅱ是大多数原核生物(如细菌)合成脂肪酸的方式,脂烯酰基酰基载体蛋白还原酶是催化细菌脂肪酸合成循环中最终步骤的酶,研究开发作用于该酶的抑制剂有可能发现新型抗菌药物。

microRNA-223过表达与抑制表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,并验证其过表达或抑制表达microRNA-223的效率。方法设计针对microRNA-223前体的过表达基因片段及针对microRNA-223成熟体的反义片段,应用聚合酶链反应(PCR)调取目的基因及通过退火反应获得双链DNA寡聚核苷酸片段。并通过基因重组技术将目的基因片段及反义片段分别克隆到GV229及GV232慢病毒载体中,进行PCR鉴定及DNA测序比对分析,构建相应的microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体。利用荧光定量PCR法检测microRNA-223表达水平。结果对阳性克隆进行PCR鉴定及DNA测序证明,microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体构建成功。microRNA-223过表达慢病毒载体能显著提高细胞中microRNA-223表达水平,microRNA-223抑制表达慢病毒载体能明显抑制细胞中microRNA-223表达水平。结论成功构建microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,为进一步研究microRNA-223对口腔癌发生发展的影响及其机制提供了稳定的细胞转染载体。

miR-18a过表达及抑制表达人鼻咽癌细胞株的构建

【目的】建立稳定miR-18a过表达及表达的人鼻咽癌细胞系,为研究miR-18a在鼻咽癌发生发展中的功能奠定基础。【方法】将miR-18a前体的编码基因片段及miR-18a反义寡核苷酸克隆到慢病毒载体中,DNA测序鉴定;将构建好的载体转染293T细胞,获得重组miR-18a过表达及抑制表达的慢病毒载体,感染人鼻咽癌细胞CNE1和CNE2,嘌呤霉素筛选获得稳定干扰miR-18a表达及过表达miR-18a的细胞系,PCR及western blot鉴定。【结果】成功构建真核表达的慢病毒miR-18a干扰载体及过表达载体,滴度均为3×10~8TU/mL;转染miR-18a抑制表达的慢病毒载体的CNE1和CNE2中ATM表达增高;与对照病毒转染相比,转染miR-18a过表达慢病毒载体的CNE1(20.3倍,P<0.01)和CNE2(122.5倍,P<0.01)中miR-18a表达显著增高,靶蛋白ATM表达下调。【结论】成功构建人miR-18a慢病毒抑制表达和过表达载体,并获得相应的慢病毒稳转人鼻咽癌细胞株。

抑制miR-29a-3p表达对小鼠巨噬细胞凋亡的影响及机制

【目的】研究miR-29a-3p下调表达对小鼠巨噬细胞凋亡及相关基因表达的影响,为探讨结核病发病机制、研发新的诊断与治疗方法提供依据。【方法】将重组抑制载体p EZX-AM02-miR-29a-3p转染RAW264.7细胞,24、36和48 h荧光显微镜观察转染效率,Real time-PCR法检测miR-29a-3p及凋亡相关基因caspase3、caspase7、caspase8、Bcl-2、Mcl-1和Bax的表达水平,流式细胞术检测RAW264.7细胞的凋亡率。【结果】重组抑制载体转染后,细胞内miR-29a-3p表达水平明显下降;而caspase7、caspase8、Bcl-2、Mcl-1和Bax等基因的表达出现不同程度的上调;流式细胞术分析发现随着转染时间延长,细胞凋亡率增加,且36 h凋亡率最高。【结论】p EZX-AM02-miR-29a-3p重组载体可抑制小鼠巨噬细胞中miR-29a-3p的表达,通过靶向上调caspase7、caspase8、Bcl-2和Mcl-1等基因的表达促进巨噬细胞的凋亡。

恒河猴miR-125a-3p慢病毒载体的构建、鉴定以及功能研究

构建携带miR-125a-3p过表达与抑制表达shRNA的慢病毒,研究miR-125a-3p对轮状病毒感染乳鼠导致的腹泻的影响,为进一步研究miR-125a-3p对轮状病毒增殖过程中的影响及探究其机制提供前期研究基础。设计miR-125a-3p前体序列及其反向互补序列,与慢病毒骨架质p LVshRNA-EGFP(2A)Puro载体进行酶切连接,构建过表达与抑制表达miR-125a-3p的慢病毒表达载体。利用HEK293Ta细胞包装慢病毒颗粒,测定病毒滴度后,将获得的miR-125a-3p过表达慢病毒颗粒感染MA104细胞和灌胃感染乳鼠,检测miR-125a-3p的表达。同时对乳鼠进行轮状病毒攻毒试验,观察腹泻情况。研究成功构建了过表达及抑制miR-125a-3p表达的慢病毒载体,获得高效的过表达及抑制miR-125a-3p的慢病毒颗粒,成功感染MA104细胞,以及在乳鼠小肠组织有表达。同时发现miR-125a-3p过表达慢病毒感染乳鼠后对轮状病毒引起的腹泻有明显的抑制作用。

壳聚糖及其衍生物在药学研究领域的新进展

介绍了壳聚糖及其衍生物在药学领域的最新研究进展,重点阐述了壳聚糖及其衍生物的生物黏附性、促吸收作用和酶抑制剂的功能载体作用,及其在新型给药系统开发中的应用。

武平悦洋含银铜多金属矿铜银分离工艺研究

武平银铜矿矿物间嵌布特征复杂,原有工艺流程选矿指标不是很理想,针对原流程存在的问题,提出铜银混合浮选—混合粗精矿再磨—铜银分离工艺流程,在铜银分离过程中提出通过载体抑制银矿物,即通过使用氧化钙+SD-1组合药剂对银的载体矿物黄铁矿等进行抑制,从而实现铜银的有效分离。通过系统试验研究,最终获得了铜品位为20.29%、铜回收率为56.45%、银品位为1670.50 g/t、银回收率为15.36%的合格铜精矿,以及铜品位为1.19%、铜回收率为36.03%、银品位为742.85 g/t、银回收率为74.32%的合格银精矿。银精矿中铜品位小于2%,有效防止了硫化铜矿在银矿物浸出过程中的不利影响。