银杏黄酮抑制Aβ_(1-42)聚集和纤维形成的分子机制

目的:探讨EGb761中银杏黄酮、银杏内酯抑制Aβ聚集和纤维形成药物作用的分子机制。方法:用园二色谱(CD)和傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)曲线拟合定量分析和特征频谱分析Aβ老化后和银杏黄酮、银杏内酯分别干预后二级结构的变化。结果:通过1700～1600cm-1之间的酰胺Ⅰ带和曲线拟合分析,Aβ1-42单独孵育30min到72h,β-折叠片增加了18.50,与银杏黄酮、银杏内酯孵育72h,β-折叠片的含量下降了50.95,36.09,β-转角的含量升高56.56,46.56。呈现出明显的β折叠片向β-转角的转化。基团特征峰谱位显示,酮类和烷烃类的-CH2和-CH参与了Aβ1-42的分子变构。结论:EGb761中银杏黄酮可能是通过抑制Aβ1-42β-折叠形成,Aβ1-42肽侧链基团发生了化学修饰达到抑制Aβ聚集和纤维形成作用。

清心开窍方抑制Aβ1-42纤维聚集的实验研究

目的:探讨清心开窍方抗Aβ1-42纤维聚集的机制。方法:实验分组:对照组、老化组单纯用Aβ1-42液,不同剂量清心开窍方组同时加入清心开窍方汤剂,老化组及不同剂量清心开窍方组均37℃恒温箱孵育7d,对照组Aβ1-42单独孵30 min,利用硫磺素T(Th-T)荧光分析法、透射电镜及扫描电镜观测Aβ1-42的聚集和纤维化程度。制备小量Affigel-Aβ,用高效液相色谱检测清心开窍方中与Affi-gel-Aβ结合的成分。结果:Th-T荧光分析示清心开窍方低、中、高剂量组对Aβ聚集与纤维形成的抑制率为分别为22.58%、75.51%、83.66%,组间比较P<0.01。透射电镜观察显示对照组Aβ1-42主要以无定型结构存在,聚集少或无明显聚集,电子密度较低,未见纤维结构形成;老化组Aβ1-42以淀粉样的纤维结构为主,交织成网状,呈针状或晶状聚集,无分枝,直径约10 nm;高、中剂量清心开窍方组Aβ1-42主要表现为无定型结构,未见明显Aβ纤维和Aβ聚集沉积,而低剂量清心开窍方组Aβ1-42主要表现为纤维型和无定型混合结构。扫描电镜观察显示对照组Aβ呈无定型,老化组纤维性结构明显增多,纤维粗,排列不规则,纵横交错,聚集形成片状结构,而清心开窍方与Aβ1-42共同孵育组,随清心开窍方浓度增加,纤维型明显减少,形成纤维束的直径逐渐变细。高效液相色谱(highperformance liquid chromatography,HPLC)检测显示:清心开窍方与Affigel-Aβ反应后,经甘氨酸(p H 2.5)洗脱的组分中存在能够被HPLC荧光检测仪检测到的物质。结论:清心开窍方具有抑制Aβ聚集和纤维形成的作用,且其中含有与Aβ结合的成分,这些成分不会促进Aβ的毒性,而可能具有抑制Aβ毒性的作用,提示在对于AD有效的中药方剂中探索与Aβ结合的成分,可能是探索AD治疗药物的一种手段。

金银花化学成分的分离鉴定与Aβ1-42聚集的抑制活性

目的对金银花(Lonicera japonica Thunb.)的化学成分进行研究,并对分离得到的化合物测试β-淀粉样蛋白聚集抑制活性。方法采用水提醇沉法对金银花干燥花蕾进行提取,并用D101大孔吸附树脂、硅胶柱色谱、ODS柱色谱法和制备HPLC法对提取物的化学成分进行分离与纯化,并根据理化性质、NMR等波谱数据对化合物进行结构鉴定,以姜黄素作为阳性对照来检测其中的木脂素类化合物(1~6)对Aβ1-42聚集的抑制活性。结果共分离得到10个化合物,分别鉴定为forsythialanside C(1)、urolignoside(2)、icariside E4(3)、(7R,8S)-erythro-7,9,9′-trihydroxy-3,3′-dimethoxy-8-O-4′-neolignan-4-O-β-D-glucopyranoside(4)、(7S,8S)-threo-7,9,9′-trihydroxy-3,3′-dimethoxy-8-O-4′-neolignan-4-O-β-D-glucopyranoside(5)、(7S,8R)-erythro-7,9,9′-trihydroxy-3,3′-dimethoxy-8-O-4′-neolignan-4-O-β-D-glucopyranoside(6),8-hydroxygeraniol-8-O-β-D-glucoside(7),kankanoside P(8),(2E,6Z)-8-(β-D-glucopyranosyloxy)-2,6-dimethyl-2,6-octadienoic acid(9),lamiuamplexoside C(10)。化合物1和2在20μmol·L-1时的抑制活性分别为74.6%和85.2%,高于阳性对照姜黄素(62.1%)。化合物3~6表现出中等程度的Aβ1-42聚集抑制活性。结论化合物1~3和7~10为首次从忍冬属中分离得到,并且研究表明苯骈二氢呋喃新木脂素糖苷类化合物C-4位与葡萄糖成苷后能明显提高对β-淀粉样蛋白聚集的抑制活性。

β淀粉样蛋白1-40和1-42的聚集性质比较

β淀粉样蛋白 (Aβ)是阿尔茨海默症 (AD)患者脑中斑块的核心蛋白 ,它由多种衍生自淀粉样前体蛋白(APP)的不同长度的肽组成 ,其中Aβ40和Aβ42是主要的组分。我们通过电镜研究了这两种蛋白的纤维形成过程。在溶液中Aβ42倾向于形成斑块状沉积 ,而Aβ40则更易于形成典型的纤维。这种不同可能由Aβ42的相对更为紧密的二级构象所致。根据这些数据 ,我们推测静电作用对于早期Aβ42聚集是非常重要的 。

PAI-1基因多态性与血小板聚集率交互作用对下肢深静脉血栓形成的影响

目的 探讨纤溶酶原激活物抑制剂1型(plasminogen activator inhibitor type 1,PAI-1)基因多态性与血小板聚集率交互作用对下肢深静脉血栓(deep vein thrombosis,DVT)形成的影响。方法 选择2020年2月~2023年2月于张家口市第一医院就诊的下肢DVT患者80例为观察组,另选80例健康者为对照组。比较两组血小板聚集率表达及多重PCR扩增目标区域后再进行高通量测序PAI-1基因基因型和等位基因频率。采用多因素Logistic回归模型分析DVT发生的危险因素,估算PAI-1基因4G/5G单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)和血小板聚集率与DVT发病风险的调整比值比(odds ratio,OR)及95%置信区间(95%confidence interval,95%CI),分析PAI-1 SNP与血小板聚集率的交互作用。结果 与对照组比较,观察组患者的血小板计数[(189.56±51.27)×10^(12)/L vs(209.16±71.91)×10^(12)/L]水平降低;D-二聚体(0.96±1.27 mg/L vs 0.45±1.26 mg/L)、PAI-1(33.26±10.12 mg/ml vs 15.14±8.56mg/ml)、卧床时间(4.12±1.20 h vs 2.32±0.78 h)和血小板聚集率(55.25%±15.56%vs 35.75%±16.23%)水平均升高,差异有统计学意义(t=1.985,2.550,12.227,11.249,7.757,均P <0.05)。观察组PAI-1 4G/5G基因型4G4G,4G5G和5G5G基因频率分别为41.25%,47.50%和11.25%,对照组分别为12.50%,67.50%和20.00%,差异具有统计学意义(χ^(2)=17.045,P <0.001)。观察组PAI-1 4G/5G等位基因4G,5G频率分别为65.00%,35.00%,对照组分别为46.25%,53.75%,差异有统计学意义(χ^(2)=11.394,P <0.001)。与5G5G基因型患者相比,基因型4G5G,4G4G患者的血小板聚集率依次升高(35.25%±12.55%vs 45.78%±13.45%,56.48%±15.26%),差异有统计学意义(t=4.297,P <0.001)。PAI-1 4G/5G位点基因型4G4G(OR=5.248,95%CI:1.787~17.124)、携带等位基因4G(OR=4.268,95%CI:1.897~15.252)和血小板聚集(OR=5.514,95%CI:1.815~21.148)是下肢DVT的独立危险因素(P<0.05)。PAI-1 4G/5G位点基因型4G4G与血小板聚集率在患者下肢DVT易感性中呈正向交互作用(3.135<1.864×2.024,为次相乘模型)。结论 PAI-1 4G/5G位点基因型4G4G和血小板聚集率在患者下肢DVT易感性中呈正向交互作用且易感性显著增加,应引起临床上重视并早期制定预防措施。

多肽抗生素apidaecin抑制CHO细胞Aβ1-42的生成

目的：γ-分泌酶具有分解老年痴呆相关前体蛋白APP从而生成具有生物毒性的Ap的作用。多肽抗生素apidaecin的已知特性显示它拟似γ-分泌酶底物。Apidaecin序列具有和APP分子蛋白中γ-分泌酶剪切位点附近相同的邻近的缬氨酸和异亮氨酸。Apidaecin序列所富含的碱性氨基酸残基（R，H）使。pidaeei。具有大量的阳离子基团，可结合γ-分泌酶中的两个保守的天冬氨酸活性基团。并且apidaecin的稳定性和极易穿透细胞膜的特性显示它具有γ-分泌酶抑制剂作用。

基于β-内酰胺酶构建大肠杆菌体内Aβ42聚集抑制剂筛选体系

淀粉样β蛋白(Aβ)的错误折叠和聚集是导致阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的主要原因,开发Aβ聚集抑制剂对于缓解和治疗AD至关重要。根据TEM1-β-内酰胺酶(TEM1-β-lactamase,βlac)的结构特征及Aβ42的聚集特性,利用分子生物学方法将Aβ42插入到βlac 196-197氨基酸残基之间,构建了BL21-βlac-Aβ42重组菌株。利用已知Aβ42聚集抑制剂,分别通过斑点滴定实验、平板涂布实验和菌体浓度变化检测实验进行了验证。结果显示,添加已知Aβ42抑制剂后,BL21-βlac-Aβ42菌株在特定氨苄青霉素(ampicillin, Amp)浓度条件下生长状况得到改善,允许微生物细胞生长的最大细胞稀释倍数增大,证明该融合体系能应用于大肠杆菌体内筛选Aβ42聚集抑制剂。该研究实现了淀粉样蛋白聚集抑制剂在微生物体内的高通量筛选,为开发新型抗Aβ聚集药物奠定了基础。

小鼠内毒素血症时肺内纤溶酶原激活物抑制剂-1长期过度表达可能抑制CD25^＋淋巴细胞聚集

法国学者对脂多糖（LPS）引起的炎症早期转基因小鼠肺内纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的作用进行了研究。结果显示，PAI-1过度表达的转基因（PAI-1Tg）小鼠与野生型（WTt）小鼠肺组织巨噬细胞和中性粒细胞浸润没有差别。但：PAI-1Tg小鼠肺组织表现为纤维蛋白沉积，而CD25^＋淋巴细胞浸润不明显。

一种新型人血小板聚集抑制剂的纯化与初步活性鉴定

目的从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化一种新型人血小板聚集抑制剂,并进行活性鉴定。方法采用阳离子交换与反相高效液相色谱法从敬钊缨毛蛛粗毒中分离到一种新型多肽组分,并命名为敬钊去整合素-I。采用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱测定分子量,用人血制备富含血小板的血浆并加入敬钊去整合素-I,采用血小板聚集仪测定二磷酸腺苷ADP诱导血小板聚集作用。结果从敬钊缨毛蛛粗毒中分离到一种新型多肽组分,其相对分子质量为3 631.42,对血小板具有明显抑制作用,但它对血小板聚集的作用受剂量的影响很大,总的趋势是较低浓度时促进血小板的聚集,较高浓度时则抑制血小板的聚集。结论敬钊去整合素-I是一种源于蜘蛛粗毒的新型人血小板聚集抑制剂,但其对血小板的影响在高浓度与低浓度时产生的效应相反,其准确的作用机制还有待深入研究。

改变食物硬度对大鼠生长早期髁突软骨中VEGF、aggrecanase-1和TIMP-3 mRNA表达的影响

目的:通过改变食物硬度造成大鼠生长早期颞下颌关节软骨的负荷改变,检测髁突软骨中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、聚集蛋白聚糖酶-1(aggrecanase-1)和金属蛋白酶抑制剂因子-3(tissue inhibitor of metallopro-teinase,TIMP-3)mRNA的表达变化,探讨其在髁突软骨发育中的意义。方法:40只21 d龄SD雌性大鼠同时哺乳与喂食粉末样食物,第28天断奶,随机分为2组:对照组仍喂食粉末样食物,实验组改喂同种成分的硬块状食物,食物改变后,在24、48h、7 d,14d每组各处死5只大鼠。解剖切取双侧髁突软骨,半定量RT-PCR检测其中VEGF、aggrecanase-1和TIMP-3 mRNA表达。结果:在硬食物组7 d和14 d髁突软骨中VEGF mRNA的表达均高于软食物组(P<0.05);在硬食物组7 d髁突软骨中aggrecanase-1 mRNA的表达高于软食物组(P<0.05);在软食物组24 h髁突软骨中TIMP-3 mRNA的表达高于硬食物组(P<0.05),其他时间点上无明显差异。结论:在改变食物负荷后aggrecanase-1和TIMP-3 mRNA在大鼠生长发育早期的髁突软骨中的表达变化是一种在生理范围内的暂时、适应性改变;而VEGF mRNA的表达变化可能参与了髁突软骨的发育并且与食物负荷的持续性成正相关,但晚于aggrecanase-1和TIMP-3 mRNA表达变化。

环氧酶抑制剂对大鼠血小板聚集的影响

目的：研究环氧酶抑制剂艾瑞昔布、氯吲昔布、美洛昔康、塞来昔布和吲哚美辛对环氧酶-1（COX-1）和环氧酶-2（COX-2）的选择性及对大鼠血小板聚集的影响，探讨环氧酶选择性抑制与血小板聚集之间的关系。方法：利用A23187刺激的小鼠腹腔巨噬细胞模型检测COX-1表达的变化；利用LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞模型检测COX-2表达的变化；利用花生四烯酸和胶原作为刺激剂诱导血小板聚集模型检测化合物对大鼠血小板聚集的影响。结果：上述化合物对COX-1和COX-2的表达均有明显的抑制作用，其对COX-1和COX-2抑制率IC50的比值分别为：艾瑞昔布IC50 coxl／IC50 cox2为6．7；氯吲昔布IC50 cox-1／IC50cox-2为3．5；美洛昔康抑制IC50cox-1／IC50COX-2为3．0；塞来昔布C50cox-1／IC50cox-2为61．5；吲哚美辛抑制IC50cox-1／IC50COX-2为0．66。艾瑞昔布、氯吲昔布、美洛昔康和吲哚美辛抑制花生四烯酸诱导的大鼠血小板聚集的IC50分别为2．98×10-6 mol／L、1．13×10-5 mol／L、6．80×10-6mol／L和1．82×10-6mol／L；其抑制胶原诱导的大鼠血小板聚集的Ic50分别为2．89×10-6mol／L、3．24×10-6mol／L、5.4×10-8mol／L和1．87×10-7mol／L。塞来昔布在10-5mol／L，浓度时对花生四烯酸和胶原诱导的血小板聚集无明显抑制作用。结论：上述化合物对环氧酶选者性抑制南强到弱的顺序依次为塞来昔布、艾瑞昔布、氯吲昔布、美洛昔康和吲哚美辛。随环氧酶抑制的选择性降低，化合物对血小板聚集制作用逐渐增强。

β淀粉样蛋白_(1-42)促进α-突触核蛋白在Ser129位点磷酸化和聚集

目的:通过转染人α-突触核蛋白(α-syn)A53T突变基因的PC12细胞(A53T-PC12细胞)模型,探讨β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)对A53T-PC12细胞在Ser29位点α-syn磷酸化(Pα-syn)水平、聚集程度的影响。方法:分别予H2O2、PBS、Aβ1-42干预A53T-PC12细胞(将A53T-PC12细胞分为:PBS干预组;5μmol.L-1Aβ1-42干预组;5μmol.L-1Aβ1-42+300μmol.L-1维生素C干预组;200μmol.L-1H2O2干预组),观察细胞内活性氧自由基(ROS)水平变化。并通过双重免疫荧光染色观察A53T-PC12细胞内α-syn聚集情况,并通过Western blot半定量分析A53T-PC12细胞内Ser129位点磷酸化Pα-syn水平。结果:Aβ1-42增加细胞内ROS。免疫荧光染色提示Aβ1-42干预后促进A53T-PC12细胞内α-syn聚集;Western blot半定量分析显示Pα-syn较PBS干预组升高(P<0.001,P<0.05)。结论:Aβ1-42促进A53T-PC12细胞内α-syn在Ser129位点磷酸化和聚集。

芍药苷活化Nrf2/ARE通路减轻Aβ_(1-42)诱导的大鼠海马神经元损伤

Aβ（1-42）是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）脑内老年斑的主要成分，其诱导氧化应激反应是邶致脑内神经元损伤和死亡的机制之一。芍药苷是中药芍药的主要有效单体成分，具有抗炎、抗氧化、抑制细胞内钙超载、保护神经元等功能。

寡聚体Aβ_(1-42)对大鼠海马突触可塑性的慢性影响

突触传递的长时程抑制(long-term depression,LTD)和长时程增强(long term-potentiation,LTP)是突触可塑性的两种重要形式,并且与学习记忆密切相关。本文探讨Sprague-Dawley(SD)大鼠在海马齿状回区(dentate gyrus,DG)注射36h孵育形成的寡聚体Aβ1-4230d后,在体海马前穿通纤维-齿状回通路(perforant path-dentate gyrus pathway,PP-DG)的突触可塑性和空间记忆能力的变化。2.5月龄SD大鼠随机分为寡聚体Aβ1-42注射组[即阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)模型组,n=12]和正常对照组(n=12),分别在双侧海马DG区注射5μg寡聚体Aβ1-42或生理盐水。应用Morris水迷宫检测大鼠空间记忆能力。同时运用神经电生理在体胞外记录技术,检测寡聚体Aβ1-42引起的海马双脉冲易化(paired pulse facilitation,PPF)、LTD、LTP等突触可塑性形式的变化。结果显示:(1)AD模型组大鼠空间记忆能力下降(P<0.05);(2)寡聚体Aβ1-42降低海马PPF强度(P<0.05),并减小PPF宽度;(3)寡聚体Aβ1-42显著抑制海马LTP形成(P<0.05),而易化LTD形成(P<0.05)。上述结果提示:寡聚体Aβ1-42对海马PP-DG通路突触可塑性的破坏,会导致大鼠空间记忆功能障碍。

HIV-1临床株SC42无感染性细胞-细胞融合模型的构建

目的构建一种无感染性、可视化,用于检测HIV-1进入抑制剂在临床株SC42上的抑制活性的HIV细胞-细胞融合模型。方法将HIV-1 SC42 env基因插入质粒pAAV-IRES-EGFP,获得可同时且分别表达HIV-1 SC42 env及GFP的真核表达质粒,经过转染293T细胞,使之同时表达这两种蛋白(293T/SC42/EGFP),作为模拟HIV病毒的效应细胞与靶细胞TZM-b1共同培养,观察细胞融合情况及合胞体的形成。使用经典HIV-1进入抑制剂C34和T1144检测该细胞融合模型的效果。结果效应细胞293T/SC42/EGFP和靶细胞TZM-b1细胞混合2 h后,在荧光显微镜下可见明显的细胞融合现象;24 h后可形成合胞体。HIV-1进入抑制剂C34、T1144能够抑制细胞融合,其IC分别为(600±6.22)nmol/L和(44±5.88)nmol/L。结论成功构建了HIV-1进入抑制剂药物检测筛选模型。该模型的构建无需在P3生物安全实验室完成,操作简单、方便且无感染性。

席夫碱衍生物的合成及其抗阿尔茨海默病活性研究

目的设计、合成了2个席夫碱衍生物,并测试其生物活性。方法通过熔点、~1H NMR和^(13)C NMR进行结构确证;分别采用硫黄素T法与透射电子显微镜法测定目标化合物抑制Aβ1-42自身聚集活性,采用氧自由基吸收能力法测定抗氧化活性,采用MTT法测定神经保护作用,以及采用紫外-可见分光光度法测定金属离子络合能力。结果目标化合物双水杨醛缩水合肼席夫碱(T1)和双水杨醛缩乙二胺席夫碱(T2)结构经确证,其中化合物T2具有较强的抑制Aβ1-42自身聚集活性(抵制率达42.8%)和选择性金属离子络合能力,同时拥有良好的抗氧化活性及神经保护作用。结论化合物T2是一个潜在多靶点抗阿尔茨海默病药物,具有良好的开发前景。

三七总皂苷基于花生四烯酸代谢通路保护胃黏膜和增强阿司匹林抗血小板作用的实验研究

目的观察三七总皂苷(PNS)保护急性心肌梗死(AMI)大鼠胃黏膜和增强阿司匹林(ASA)抗血小板的作用,并基于花生四烯酸(AA)代谢通路探讨其机制。方法结扎左冠状动脉前降支建立Wistar大鼠AMI模型,随机分为AMI模型组(model组)、ASA组、PNS组、PNS+ASA组,同时设假手术组(sham组),每组10只。造模后第2天各给药组给予相应药物灌胃,model组和sham组给予等量生理盐水,每日1次。灌胃4周后,TTC染色计算心肌梗死面积,光比浊法测定血小板聚集率,扫描电镜观察胃黏膜超微结构,ELISA法检测血小板环氧化酶-1(COX-1)活性,western blot法检测血小板COX-1蛋白,液相色谱-质谱联用技术检测血清、血小板及胃黏膜AA通路脂质代谢物水平。结果 model组心肌梗死面积、血小板聚集率较sham组显著升高(P<0.01);ASA组、PNS组、PNS+ASA组心肌梗死面积、血小板聚集率较model组显著降低(P<0.01);与ASA组比较,PNS+ASA组心肌梗死面积、血小板聚集率进一步降低(P<0.01)。ASA组胃黏膜上皮细胞明显损伤,PNS+ASA组胃黏膜上皮细胞损伤较ASA组明显减轻。model组血小板COX-1活性及表达较sham组升高(P<0.01);ASA组、PNS组、PNS+ASA组COX-1活性及蛋白表达较model组降低(P<0.01),且PNS+ASA组较ASA组进一步降低(P<0.01)。与单用ASA相比,PNS联合ASA能进一步升高血清总表氧二十碳三烯酸(P<0.01),降低血小板血栓素B_2水平(P<0.01),升高胃黏膜前列腺素E_2及下游代谢物水平(P<0.01)。结论 PNS联合ASA能减轻ASA诱导的胃黏膜损伤,增强ASA抗血小板作用,机制与调控AA代谢通路有关。

急性冠状动脉综合征合并糖尿病患者纤溶系统及血小板功能的研究——附68例报告

目的:探讨ACS合并2型糖尿病患者纤溶系统及血小板最大聚集率的变化。方法:256例ACS患者,根据其是否合并2型糖尿病分为糖尿病组(68例)及非糖尿病组(188例),并将100名同期在本院行体检的正常志愿者设为对照组。测定所有人员的组织型纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制物-1含量及血小板最大聚集率,比较组间差异。结果:糖尿病组血浆组织型纤溶酶原激活物含量[(5.5±1.7)μg/L]较非糖尿病组[(8.8±1.5)μg/L]低,而两组均较对照组[(9.7±2.8)μg/L]低(P<0.01～P<0.05)。糖尿病组纤溶酶原激活物抑制物-1含量[(45±3)μg/L]较非糖尿病组[(35±3)μg/L]高,而两组均较对照组[(17±7)μg/L]高(P<0.01～P<0.05)。糖尿病组血小板最大聚集率[(78±14)%]明显高于非糖尿病组[(66±11)%],而两组均较对照组[(56±14)%]高(P<0.01～P<0.05)。结论:ACS合并2型糖尿病患者与单纯ACS患者比较,其纤溶系统异常更明显,血小板凝聚性更强,提示此类患者应加强抗凝及抗血小板治疗。