七种蛋白酶抑制剂对多房棘球蚴DNA损伤诱导样1蛋白活性的影响

目前,多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)尚无有效药物治疗手段,迫切需要开发新型治疗药物。前期研究表明,HIV蛋白酶抑制剂(HIV protease inhibitors, HIV PIs)具有潜在抗寄生虫功能。本文旨在研究HIV PIs对Echinococcus multilocularis(Emu)DNA损伤诱导样1蛋白(DNA damage inducible 1 protein, Ddi1)活性的影响。本研究通过构建真核表达重组载体pFastBac1-Emu Ddi1,在昆虫细胞系Sf9细胞中表达筛选出P1代和P2代,纯化出可溶性Ddi1重组蛋白,然后与目的蛋白的荧光底物检测纯化蛋白的活性,进一步检测沙奎那韦(saquinavir, SQV)、利托那韦(ritonavir, RTV)、安普那韦(amprenavir, APV)、阿扎那韦(atazanavir, ATV)、洛匹那韦(lopinavir, LPV)、福沙那韦(fosamprenavir, Fos)、达芦那韦(darunavir, DRV)等7种HIV PIs对Emu Ddi1重组蛋白活性的抑制能力。结果显示:细胞系内真核表达产物的酶活Km为1.422μmol·L^(-1),具有良好的亲和力和活性,最终筛到沙奎那韦对Ddi1蛋白二聚体活性位点的抑制率达67%,其IC_(50)为34,说明沙奎那韦对Emu Ddi1重组蛋白酶活性具有良好的抑制效果。以上结果提示:沙奎那韦抑制重组蛋白Ddi1的活性,可能成为Ddi1的靶向药物,以期为替代药物或开发联合用药提供基础。

二硫键桥Cys^(2nd)-Cys^(6th)缺失对典型TIL类蛋白酶抑制剂抑制活性和特异性的影响

笔者对AmCI,AsATI和AsC/E-1的编码序列进行密码子优化和基因合成,并利用点突变技术对其关键位点Cys^(2nd)和Cys^(6th)进行替换,结合原核表达和胶内活性染色分析,探讨Cys^(2nd)-Cys^(6th)对典型TIL类蛋白酶抑制剂抑制活性和抑制特异性的影响.SDS-PAGE结果显示,AmCI,AsATI和AsC/E-1及其突变体在上清中皆有表达.胶内活性染色结果显示,AmCI和AsC/E-1不仅能抑制胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶活性,还能强烈抑制枯草杆菌蛋白酶活性,但对胰蛋白酶没有抑制作用.AsATI能抑制胰蛋白酶活性,却不能抑制胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶活性.将Cys^(2nd)和Cys^(6th)分别替换为Asp和Leu后,AmCI,AsATI和AsC/E-1原有的抑制活性皆大大降低.值得注意的是,AsATI的突变体产生了微弱的枯草杆菌蛋白酶抑制活性.上述研究结果表明,Cys^(2nd)-Cys^(6th)对典型TIL类蛋白酶抑制剂的抑制活性和抑制特异性至关重要.笔者希望该研究不仅可为AmCI,AsATI和AsC/E-1的生理功能研究奠定基础,还能为TIL类蛋白酶抑制剂活性和特异性的定向改造提供一定的依据.

尿胰蛋白酶抑制剂分离纯化研究进展

尿胰蛋白酶抑制剂(Urinary Trypsin Inhibitor,UTI)是从人类尿液中分离纯化得到的一种具有丝氨酸蛋白酶抑制活性的硫酸软骨素蛋白聚糖,其对胰蛋白酶、透明质酸酶、粒细胞弹性蛋白酶、纤溶酶等蛋白酶均具有良好抑制作用,被广泛用于临床治疗急性胰腺炎和作为急性循环衰竭的抢救辅助用药。本文主要综述了尿胰蛋白酶抑制剂的来源、结构、生理功能、传统分离纯化工艺以及基因工程技术生产新方法等,旨在为尿胰蛋白酶抑制剂的高质量生产以及应用提供参考。

马铃薯蛋白酶抑制剂酶解产物超滤组分的抗氧化活性与结构特征

超声波联合蛋白酶K酶解马铃薯蛋白酶抑制剂,研究酶解产物(PPIHs)的理化性质、抗氧化稳定性及其超滤后各组分的抗氧化活性及结构特性。结果表明,超声联合酶解处理后,PPIHs的溶解度和乳化及乳化稳定性增强;抗氧化稳定性在80℃以下较好,超过80℃有下降趋势;在酸性或非碱性环境下,除对ABTS自由基的抗氧化稳定性较差,PPIHs对其他自由基的抗氧化稳定性较好。PPIHs经过超滤得到PPIHs-Ⅰ(>10 ku)、PPIHs-Ⅱ(3~10 ku)和PPIHs-Ⅲ(<3 ku)3种超滤产物,PPIHs-I对ABTS自由基的清除能力最强,Zeta电位的绝对值显著增大;PPIHs-II的抑制油脂氧化以及对-OH和DPPH自由基的清除能力较强,粒径显著减小。紫外吸收光谱、红外光谱和荧光光谱表明,酶解产物的结构发生改变,如无规卷曲和β-转角含量提高,β-折叠和α-螺旋减少,疏水性增强等,进而改善其抗氧化活性。

二至丸中抑制组织蛋白酶K活性的物质基础研究

目的考察传统补肾经典名方二至丸中抑制组织蛋白酶K的活性部位和活性成分。方法采用高通量荧光方法筛选二至丸中正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和石油醚提取部位,以及二至丸主要活性成分对组织蛋白酶K(CTSK)与荧光合成底物Z-FR-MCA结合活性的抑制率,和对CTSK与硫酸软骨素A(CSA)复合物形成活性抑制率。进而考察二至丸不同提取部位和活性成分抑制CTSK生理底物I型胶原蛋白降解活性,并采用分子对接和底物结合实验验证潜在CTSK抑制剂。结果二至丸的正丁醇和石油醚提取部位对CTSK与CSA复合物形成抑制率超过90%,石油醚提取部位对CTSK与底物Z-FR-MCA结合抑制率超过90%,正丁醇提取部位对CTSK的胶原降解抑制率超过95%、石油醚提取部位为58.6%。30个有效成分中11个显示对CTSK与CSA复合物形成抑制率超过50%,有5个成分对CTSK与荧光底物Z-FR-MCA结合活性抑制率超过50%。最终筛选确定4个成分墨旱莲皂苷Ⅸ、表儿茶素没食子酸酯、女贞苷和蟛蜞菊内酯,对胶原降解抑制率超过50%,其中墨旱莲皂苷Ⅸ抑制胶原纤维与CTSK的结合率最高达60%,但均与CTSK活性位点分子对接不成功。结论二至丸中存在抑制组织蛋白酶K的活性物质,主要存在于正丁醇部位,但活性成分不是活性位点抑制剂,可能通过与其他位点结合,间接抑制CTSK与寡多糖结合,进而降低了CTSK的胶原降解活性。

甲磺酸加贝酯衍生物的合成及其对蛋白酶活性的抑制

通过生物电子等排原理,以6-胍基己酸盐酸盐为起始原料,与含有酚羟基的不同取代苯甲酸乙酯,经过缩合和酸化反应,设计和合成了甲磺酸加贝酯及其衍生物。同时,考察了这些衍生物与胰蛋白酶相互作用,对胰蛋白酶抑制剂活性进行了初步评价,其TIA值为0.93~1.23 mg/g之间。结果表明:结构中的胍基和酯基对于抑制蛋白酶的活性至关重要,为后续的甲磺酸加贝酯类药物研究提供改造思路,奠定初步工作基础。

单味中药及其有效成分组织蛋白酶K抑制剂研究进展

组织蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)属于半胱氨酸蛋白酶,是抗骨质疏松药物研发的重要靶点,在破骨细胞中特异性高表达,对降解骨胶原基质至关重要。与临床常用的抑制骨吸收药物相比,CTSK抑制剂具有在不影响骨形成的情况下有效减少骨吸收的优点。迄今为止,CTSK抑制剂的研发均因安全性不足而失败,原因是对皮肤和血管系统等非骨组织造成副作用。传统中药富含抑制骨吸收的活性物质,一些文献表明中药来源的CTSK抑制剂抗骨质疏松作用明显,且没有明显的不良反应。笔者拟综述近10年中药来源的CTSK抑制剂的研究进展,资料主要来源于中国知网、万方和Web of Science数据库,为开发中药CTSK抑制剂和治疗CTSK相关疾病提供参考。

蛋白酶抑制剂对梨小食心虫幼虫中肠蛋白酶活性的影响

【目的】梨小食心虫Grapholitha molesta(Busck)是一种危害极其严重的果树害虫。中肠蛋白酶在昆虫生长发育过程中起着重要作用。本研究测定梨小食心虫幼虫中肠内蛋白酶活性的最适p H、蛋白酶抑制剂和激活剂对蛋白酶活性的作用,为利用蛋白酶抑制剂防治该害虫提供新思路。【方法】提取梨小食心虫3龄幼虫中肠液,利用酶专性底物测定各蛋白酶在3种不同缓冲溶液中的最适p H(dd H2O为对照)、蛋白酶抑制剂和激活剂对中肠蛋白酶活性的影响,同时测定饲喂蛋白酶抑制剂(PMSF,TLCK,TPCL和STI)后梨小食心虫中肠蛋白酶活性的变化。【结果】梨小食心虫幼虫中肠总蛋白酶在Tris-HCl,KH2PO4/Na OH和Glycine/Na OH 3种缓冲液中最适p H分别为10.5,11.0和11.0,强碱性胰蛋白酶的最适p H分别为10.5,11.0和11.0,弱碱性胰蛋白酶的最适p H分别为8.5,9.0和9.0,胰凝乳蛋白酶的最适p H分别为8.5,9.0和9.5。5种蛋白酶抑制剂(DTT,PMSF,TLCK,TPCL和STI)中,除TLCK对凝乳蛋白酶激活外,其他蛋白酶抑制剂对4种蛋白酶均表现为抑制,且浓度越大抑制效应越明显。抑制剂DTT对总蛋白酶和弱碱性胰蛋白酶的抑制效果高于其他抑制剂。4种蛋白酶激活剂(Mg Cl2,Ca Cl2,EDTA和EGTA)中,Mg Cl2抑制总蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性,而激活胰蛋白酶活性;Ca Cl2激活总蛋白酶和弱碱性胰蛋白酶活性,而抑制强碱性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,EDTA对4种蛋白酶均表现为抑制,EGTA除对强碱性胰蛋白酶表现为激活外,对另外3种蛋白酶表现抑制。用蛋白酶抑制剂PMSF,TLCK,TPCL和STI饲喂梨小食心虫幼虫,各抑制剂均可抑制4种蛋白酶活性,且在不同取样时间抑制水平不同。其中STI(50μg/m L)对4种蛋白酶的抑制效果高于其他抑制剂,且浓度越大抑制效应越明显。10,20和50μg/m L STI 3种浓度处理组,在取食后4 h时,4种蛋白酶活性升高,且上升程度与STI浓度有关;酶活性在20μg/m L STI处理后48 h,50μg/m L STI处理后60 h时最低,抑制剂STI表现出持效性。【结论】蛋白酶抑制剂对梨小食心虫幼虫中肠蛋白消化酶的活性具有一定的抑制作用,其中大豆胰蛋白酶抑制剂STI在害虫防治中具有极其重要的应用价值。

中华鲟半胱氨酸蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的表达和活性分析

为研究鱼类半胱氨酸蛋白酶抑制剂 (Cystatin)的功能并探索其在水产加工和病害防治中的应用潜力 ,将PCR改造后的编码成熟肽中华鲟 (Acipensersinensis)cystatin基因亚克隆到毕赤酵母整合型表达载体pPICZαA ,氯化锂法转化毕赤酵母菌株GS115 ,构建表达cystatin的酵母基因工程菌。经甲醇诱导、SDS PAGE检测培养基上清液 ,表明中华鲟cystatin在毕赤酵母中实现了高效表达 ,重组cystatin表达量约为 2 15mg·L- 1 。纯化后重组蛋白纯度达94 .2 %。生物活性检测结果表明 ,1μg重组中华鲟cystatin约能抑制 15

大豆蛋白酶解肽的分子量分布及抑制ACE活性关系研究

研究不同蛋白酶作用的酶解肽表现在血管紧张素转化酶(ACE)活性抑制差异,酶解产物的水解度、分子量分布与ACE抑制率的相互关系。用胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶等五种蛋白酶对大豆分离蛋白酶解,进行了多肽增量、水解度、超滤膜分离及其ACE抑制率对比等实验。结果表明,碱性蛋白酶的多肽增量最大,胃蛋白酶次之,依次为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶,胰蛋白酶则出现反常;水解度随着酶解的时间而增加,碱性蛋白酶的最大水解度可达到21%,依次为胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶,最低为胰蛋白酶仅为9%左右;与此对应的碱性蛋白酶的酶解物的ACE活性抑制率为最高(44.9%),胃蛋白酶次之(43.5%)。分子量范围在1000Da以下组分对ACE的抑制效果最高,碱性蛋白酶作用获得的小分子肽组成为71.25%,胃蛋白酶的为69.35%,但其对应的ACE抑制率却为64.57%和78.49%。中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶作用获得的小分子肽的ACE抑制率分别为45.7%、47.3%和29.6%。胃蛋白酶的降压肽制备效果为最好,其次为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶。

一种苦荞麦种子蛋白酶抑制剂的纯化、特性及其抗虫活性(英文)

蛋白酶抑制剂广泛存在于生物体内,是自然界含量最为丰富且具有一定防御作用的蛋白种类之一.本文采用离子交换层析和凝胶层析等方法,从苦荞麦种子中分离出一种胰蛋白酶抑制剂(TBTI-Ⅱ) .SDS-PAGE分析表明,TBTI-Ⅱ的分子量约9·0 kD,由80个氨基酸残基组成,分子中含有较多的Glu, Asp和Arg. TBTI-Ⅱ具有较高热稳定性.当在100℃加热处理10 min后,仍保留有67·6 %的抑制剂活性.动力学测定显示,来自苦荞麦中的TBTI-Ⅱ对胰蛋白酶的抑制作用常数(Ki)为1·01×10-4mol/L.另外,将含有不同活力单位的苦荞麦蛋白酶抑制剂掺入到棉铃虫的饲料中进行饲养试验显示,TBTI-Ⅱ具有明显的抑制棉铃虫生长的作用.这些结果表明,来自苦荞麦种子中的小分子蛋白酶抑制剂可能是一种潜在的抗虫因子.

一种快速检测蛋白酶抑制剂电泳活性的染色方法

根据特异蛋白酶抑制剂抑制靶蛋白酶的作用而阻止水解的原理 ,借助明胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品 ,胶板经蛋白酶水解后 ,以考马斯亮蓝染色 ,建立了一种简便、直观、灵敏的检测蛋白酶 (胰蛋白酶 )抑制剂活性的染色方法 。

胰蛋白酶抑制剂及其抗肿瘤活性研究进展

简要综述近年来胰蛋白酶抑制剂特别是水生生物胰蛋白酶抑制剂的制备及其抗肿瘤活性方面的研究进展,并对今后的研究方向作了展望。

连翘酯甙分离提取及抑制弹性蛋白酶活性研究

Forsythiaside was obtained by using macro reticular resin D 101 and vaccum liquid chromatography.Using the method of agarose diffusion,the inhibition of porcine pancreatic elastase by forsythiaside was studied.The results shown that forsythiaside could inhibit the activity of porcine pancreatic elastase.

四种常见鱼卵对丝氨酸蛋白酶抑制活性的比较

选择胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及其特异底物,建立比色法检测,对沙塘鳢、鲫鱼、草鱼、乌鳢鱼卵的丝氨酸蛋白酶抑制活性进行了比较。试验结果表明,胰蛋白酶抑制活性依次为乌鳢>草鱼>沙塘鳢>鲫鱼;弹性蛋白酶抑制活性依次为沙塘鳢>鲫鱼>草鱼>乌鳢;枯草杆菌蛋白酶抑制活性依次为沙塘鳢>鲫鱼>草鱼>乌鳢,胰凝乳蛋白酶活性只受乌鳢抑制。研究表明这可能与抑制剂P1位点的残基种类有关。此外还对鱼卵中的抑制剂成分进行热稳定性与酸碱稳定性的检测,结果表明其具有很强的热稳定与酸碱稳定性。

豆制食品中胰蛋白酶抑制剂活性测定方法的改进

在ISO 14902:2001《动物饲料—大豆制品胰蛋白酶抑制剂活性的测定》方法的基础上,对影响豆制食品中胰蛋白酶抑制剂活性测定的一些关键因素进行改进与补充,为豆制食品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定提供新方法。采用分光光度法,对样品提取方法、样品脂肪含量、提取液过滤与否影响、结果计算公式等进行相应改进研究,使改进后的测定方法操作简便快速、变异系数小,适用性强、计算方式简单、计算结果准确、检测速度提高并具有足够高的重复性等优点,适宜日常豆制食品检验工作的开展。

黄芪注射液体外对大鼠血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-2活性的抑制作用

目的:探讨黄芪对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)分泌的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)活性的抑制作用及其调节机制。方法:以黄芪注射液刺激体外培养的SD大鼠VSMC,Zymography法检测培养细胞上清液中MMP-2的活性,Western印迹法观察MMP-2蛋白水平变化。结果:黄芪在体外抑制大鼠VSMC分泌MMP-2的活性,且此作用呈浓度依赖性。结论:黄芪在体外抑制大鼠VSMC分泌MMP-2的活性,此作用为转录后调节。

基质金属蛋白酶1、3,基质金属蛋白酶组织抑制剂1和miR-29在大鼠肺纤维化中及活性维生素D3处理后的表达与作用

目的:探讨大鼠肺纤维化发生发展中基质金属蛋白酶1(MMP1)、MMP3、基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)及miR-29的表达和作用以及活性维生素D3[1,25(OH)_2D_3]处理对这些基因表达的影响。方法:雄性SD大鼠随机分为预防组和治疗组。预防组分为对照组Ⅰ、模型组Ⅰ和给药组Ⅰ,治疗组分为对照组Ⅱ、模型组Ⅱ和给药组Ⅱ。模型组Ⅰ/Ⅱ和给药组Ⅰ/Ⅱ经气管注入博莱霉素,对照组Ⅰ/Ⅱ经气管注入生理盐水。预防组和治疗组分别于术后第2和14天腹腔注射给药,给药组给予活性维生素D3,模型组给予活性维生素D3溶剂,对照组给予生理盐水。预防组的各组分别于术后第14、21、28天处死大鼠取材,治疗组的各组分别于术后第21和28天处死大鼠取材。实时定量PCR检测大鼠肺组织中miR-29a及TIMP1 mRNA表达水平,免疫组织化学检测组织中MMP1、MMP3和TIMP1的表达水平。结果:模型组Ⅰ/Ⅱ和给药组Ⅰ/Ⅱ中的MMP1、MMP3和TIMP1的表达均明显高于相同时间点对照组Ⅰ/Ⅱ中的表达,而miR-29a的表达明显低于相应的对照组Ⅰ/Ⅱ;给药组Ⅰ/Ⅱ中MMP1、MMP3和TIMP1的表达均低于相应时间点的模型组Ⅰ/Ⅱ的表达,而给药组Ⅰ/Ⅱ中miR-29a的表达则高于模型组Ⅰ/Ⅱ中的表达。结论:MMP1、MMP3、TIMP1和miR-29在大鼠肺纤维化发生发展中具有重要作用,活性维生素D3可以促进miR-29表达,抑制MMP1、MMP3、TIMP1的表达;可能是通过miR-29调节包括MMP1、MMP3、TIMP1在内的多种靶基因来发挥抑制纤维化的作用。

α-卤代丁二酰氧肟酸类基质金属蛋白酶抑制剂的合成及活性评价

基质金属蛋白酶(MMPs)是一族Zn2+依赖的蛋白水解酶.该族酶的过度表达与多种病理过程密切相关,因此其抑制剂可用于这些疾病的治疗.本文设计合成了15个α-卤代丁二酰氧肟酸类新型基质金属蛋白酶抑制剂,经核磁共振氢谱和质谱进行了结构表征,并以伊洛马司他(Ilomastat)为阳性对照,分别测定了它们对基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的体外抑制活性.结果显示,4个化合物对MMP-2的抑制活性与阳性对照相当;5个化合物对MMP-9的抑制活性与对照药相当.