双重抑制PCR技术分离鹅微卫星标记

用双重抑制PCR技术分离11对鹅的特异微卫星引物,应用于浙东白鹅和太湖鹅的基因组PCR扩增。结果表明:11对引物在浙东白鹅和太湖鹅中分别扩增出37和36个清晰条带,20个等位基因为两品种所共有,11对引物中有5对呈中等多态、6对呈高度多态。各位点产生2～6个等位基因,各位点的平均杂合度为0.456～0.772,以G07位点为最高,G06位点为最低;平均多态信息为0.375～0.737,以G07位点为最高,G01、G03和G11位点为最低。浙东白鹅和太湖鹅有效等位基因数分别为2.655和2.558,与实际测得的两品种平均值3.364和3.273较接近。研究结果表明,两品种的等位基因分布较为均匀,与鹅的实际品种特征一致,因此,双重抑制PCR技术适合于鹅的基因组结构研究。

利用双重抑制PCR技术分离鸭微卫星标记

用双重抑制PCR技术分离10对鸭的特异微卫星引物，应用于北京鸭、樱桃谷鸭、高邮鸭3个品种的基因组PCR扩增。结果表明：10对引物中有7对引物具有多态，3对呈高度多态，4对呈中度多态。7对引物在上述3个鸭品种中分别扩增出23、22、23个等位基因，其中15个等位基因为3个品种所共有；各位点产生4～7个等位基因，平均杂合度为0．494～0．650，平均多态信息含量为0．414～0．586，平均有效等位基因数为2．001～2．870。3个鸭品种的平均杂合度分别为0．578、0．566、0．594，平均多态信息含量分别为0．496、0．480、0．524；平均有效等位基因数分别为2．441、2．340、2．615，与实测平均等位基因数3．286、3．1z12、3．286较接近。

抑制PCR技术及其在基因分析中的应用

介绍了ＰＣＲ技术在基因组走步、寻找基因旁侧序列、从总ＲＮＡ构建ｃＤＮＡ文库、分析样本间共同序列、构建均等化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ｃＤＮＡ文库、构建差异表达的ｃＤＮＡ文库中的应用。

抑制PCR富集法分离三化螟基因组微卫星分子标记

采用抑制PCR的方法构建三化螟的微卫星文库,并分离微卫星分子标记。挑取的201个阳性克隆测序结果表明,187个克隆含有微卫星序列,抑制PCR筛选微卫星序列的准确率达到93.03%。对该187个微卫星序列进行比对,得到18个不同的微卫星序列,并成功提交至GenBank。对这18个序列设计了30对特异性引物,检测德阳种群48个体,共得到5个三化螟微卫星分子标记。

应用改进的SSP-抑制PCR技术扩增cDNA片段旁侧序列

结合抑制PCR和单链特异引物PCR技术，降低RACE过程中由公用引物引发的非特异扩增、增加目的cDNA在原始模板中的相对比例，从而提高RACE特异性，有效地扩增靶序列。

数据库搜索及ISSR-抑制PCR法开发香菇微卫星标记

采用数据库搜索及ISSR-抑制PCR法开发香菇微卫星标记。由数据库搜索法开发出21对引物,11对有多态性,各位点平均产生3.3个等位基因;通过ISSR-抑制PCR法开发出8对引物,5对具多态性,各位点平均产生3个等位基因。结果表明,在香菇SSR开发中,两种方法均是行之有效的。

血液和骨髓标本中常见PCR反应抑制物的探究与分析

PCR反应具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、高效安全及对标本要求低的特点,是检测标本中DNA或mRNA的首选方法,大量应用于临床和科研。近年来逆转录荧光定量PCR技术(real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR)取得了飞速发展,检测灵敏度不断提高,有的甚至可以检测低于10个拷贝数的基因。技术的进步必然会对标本提出更高的要求,因此有必要重新审视血液和骨髓液中可能存在的PCR反应抑制物。本文总结了血液和骨髓液中常见的PCR反应抑制物及其可能存在的抑制机制和解决措施,重点阐述了抗凝剂肝素的使用对于PCR反应的影响。本文可在一定程度上指导对PCR(特别是qRT-PCR)检测结果的评估,如对于某些低表达基因定量检测结果临床意义的判断,或者排除标本中PCR抑制成分所导致的假阴性等。

利用抑制性PCR提高兼并引物扩增效率及特异性

为提高兼并引物PCR的特异性和扩增效率,改进了兼并引物的设计,在兼并引物上加入接头序列,使其延长,并利用该方法成功获得了一个新的聚酮类合成酶的基因片段,表明抑制性PCR能够提高兼并引物扩增的效率及特异性.

香蕉果实采后抑制差减文库的构建与鉴定

抑制差减杂交技术(suppressionsubtractivehybridization,SSH),是抑制PCR与差减杂交技术相结合而产生的。其优点是在差减杂交过程中使不同丰度cDNA的拷贝数差异趋于均衡,因此不同丰度的差异表达基因都能得到有效克隆,能有效分离低丰度的差异表达基因,避免了表达序列标签分析中高丰度基因重复测序的缺点。因此SSH技术被应用于植物差异表达基因的分离。香蕉果实采后成熟过程中发生一系列复杂的生理变化,这些变化涉及到许多基因的表达。为了研究香蕉果实采后与采前在基因表达上的差异,我们首次采用抑制缩减文库的方法,以分离香蕉果实在采后表达的基因。以采后0h的香蕉果实cDNA为驱动子,对香蕉果实采后48h果实cDNA为待测子,进行抑制缩减杂交,抑制缩减杂交产物与pGEM-TEasyVecter连接,转化E.coliDH5琢,构建了抑制缩减文库。该文库共包含312个克隆,采用PCR方法对文库进行了重组子的鉴定,共有302个重组子。该文库的构建成功为深入研究香蕉果实采后基因的表达奠定了基础,为研究香蕉果实采后成熟的分子生物学机理提供了一个新的思路。

抑制性消减杂交在生物基因克隆中的应用

抑制性消减杂交(SSH)是抑制PCR与消减杂交技术相结合,能对未知序列差异表达基因克隆的一种方法。该方法具有速度快、效率高、假阳性率低、目的序列富集程度高、实验结果复杂程度低等特点。本文主要介绍其基本原理、操作过程、优缺点、在生物基因克隆中的应用,并对其应用前景进行了分析。

抑制性消减杂交技术原理及应用

0引言 抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA消减杂交技术.通过合成两个不同的接头,连接于测试cDNA片段的5'末端,达到选择性扩增差异性表达的cDNA片段,抑制非目的cDNA的扩增.该技术与其他消减杂交技术相比具有假阳性率低、敏感性高、效率高等优点而得到广泛应用.

抑制性消减杂交技术及其应用研究进展

抑制性消减杂交(SSH)技术是结合抑制性PCR和消减杂交技术发展起来的一种高效分离差异表达基因的方法,具有特异性高、假阳性率低、操作简便、速度快、效率高等优点。利用SSH技术进行不同状态下基因的表达变化分析、差异基因的克隆和鉴定对了解基因表达调控有着重要意义。为此,综述了SSH技术的原理及其在发育调控基因、疾病发生机制、药物研发、性状筛选及环境生物修复等方面的应用研究进展。

青虾(Macrobrachium nipponense)Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子基因全长cDNA的克隆及表达

采用RACE技术,首次从青虾精巢中克隆得到KSPI基因全长cDNA。青虾KSPI基因cDNA全长890bp,包括80bp的5′UTR,546bp的3′UTR和编码87个氨基酸残基的264bp开放阅读框。预测蛋白包含1个保守的Kazal型结构域(CⅠX5CⅡX(6)VCⅢX(5)TYXNXCⅣX6CⅤX12CⅥ),结构域中P1活性位点为苏氨酸残基。应用MEGA4.1软件对青虾与已报道的虾类共15种KSPI氨基酸序列进行系统进化分析,结果表明,青虾KSPI与同样来源于精巢的罗氏沼虾KSPI进化关系最近聚为一支,其它虾类来源于肝胰腺和血细胞的KSPI聚为另外两支。采用定量PCR技术分析其组织分布,结果显示,KSPI基因在精巢、心脏和卵巢中有较高表达,其中精巢表达水平极高,并与心脏和卵巢表达差异分别达到显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)水平,其它组织表达较弱。

SCODA技术和磁珠法对法医生物检材抑制物去除效果比较

目的比较SCODA技术和磁珠法对法医物证常见PCR抑制物腐植酸和黑色素的去除效果。方法将腐植酸溶液和黑色素溶液分别与两份直径为1mm的血片混合制成模拟DNA样本,采用Global Filer?试剂盒进行STR分析,比较添加较高浓度腐植酸(600μg)和黑色素(200μg)而分别经基于SCODA技术的Aurora核酸纯化系统和基于磁珠法的Auto Mate Express TM自动化提取仪纯化处理的两种方法的效果,通过检出STR分型的完整性进行评估。结果含有腐植酸(600μg)和黑色素(200μg)的模拟DNA样本,经Aurora核酸纯化系统纯化后可检出所有基因座的等位基因,而经Auto Mate Express TM自动化提取仪纯化后则未检出等位基因。结论SCODA技术对较高浓度的PCR抑制物腐植酸和黑色素具有更好的去除效果。

罗田甜柿Ty1-copia类逆转座子RNaseH-LTR序列的分离和特性分析

逆转座子序列信息的获得,对了解其在基因组中的行为及系统学研究有重要价值。本试验从罗田甜柿(Diospyros kaki Thunb.‘Luotian-tianshi’)基因组中分离出31个RNaseH-LTR(long terminal repeat,长末端重复)序列,并利用逆转座子间扩增多态性(inter-retrotransposon amplified polymorphism,IRAP)技术对部分序列相应的逆转座子家族在柿属植物中的转座活性及分布情况进行初步探讨。序列分析结果表明,至少有10个Ty1-copia类逆转座子家族得到扩增;其家族间普遍表现高度异质,碱基替换、插入或缺失突变,以及翻译成氨基酸后发生不同程度的终止密码子突变、氨基酸取代和移框突变等,是产生高异质性的原因;此外,其家族内部某些序列间的相似性极高,可能是寄主基因组与逆转座子间互惠关系的体现。应用部分逆转座子引物的IRAP分析结果表明,相应的逆转座子家族在柿属植物中普遍存在,其分布广泛,拷贝数高,转座活性强,具有进一步开发为多种逆转座子分子标记的潜力。

库拉索芦荟6号染色体表达序列标签的研究

将微分离的库拉索芦荟(Alove vera[L.]Burm.f)6号染色体DNA及库拉索芦荟叶总cDNA分别用LA-PCR(linker adaptor polymerase chain reaction)方法扩增,然后采用杂交片段扩增技术(hybrid specific amplification,HSA)分离6号染色体与cDNA同源的表达序列片段.对表达序列片段进行克隆,得到约40 000个重组子.随机选取96个克隆进行分析,分别用DIG标记6号染色体的LA-PCR产物和cDNA扩增产物作探针对其进行点杂交,对显示阳性信号的克隆进行测序.将库拉索芦荟6号染色体的表达序列标签(expressed sequence tags,EST)与GenBank中核苷酸进行比较,发现库拉索芦荟6号染色体的表达序列中有87.4%与植物的EST具有同源性,12.6%的EST与人或动物的EST具有较弱同源性,其中与石刁柏的EST及非生物素胁迫下的小麦(Triticum aestivum)、咖啡(coffee)、高梁(Sorghum bicolor)和菠萝(pineapple)等作物的EST具有很高的同源性(>93%).

生物检材中的PCR抑制物及其处理技术

DNA分型技术在刑事案件的侦破中已得到广泛应用,但不同来源的各种生物检材往往含有PCR抑制物,其对扩增反应的影响不容忽视。因此,DNA样本扩增前预处理就显得尤为重要。本文主要就PCR抑制物种类及其对PCR的抑制机制、PCR抑制物应对技术等相关研究进展进行简要综述,旨在为相关研究和应用提供参考。

两种国产磁珠试剂盒对常见PCR抑制物去除效果比较

目的比较国产博坤磁珠试剂盒和Wawasye磁珠试剂盒对法医学常见PCR抑制物的去除效果。方法选择6种常见PCR抑制物,胆汁酸盐、胶原质、腐殖酸、血红素、黑色素和尿素,分别将其与K562 DNA混合后,采用Identifiler试剂盒进行分型,以恰好抑制K562 DNA所有26个不同等位基因的抑制物浓度为标准添加浓度,在此基础上提高每种PCR抑制物的浓度,分别采用两种磁珠试剂盒对混有抑制物的标准品DNA进行纯化处理后,再进行PCR扩增和STR分型检测,统计STR基因座等位基因检出个数。结果分别混有1×、2×和4×标准添加浓度各种抑制物的K562 DNA经博坤磁珠试剂盒纯化后,均可检出所有STR基因座的全部等位基因;经Wawasye磁珠试剂盒纯化后,混有胆汁酸盐、胶原质、血红素和尿素的DNA均可检出所有STR基因座的全部等位基因,而混有腐殖酸和黑色素的DNA未检出任何等位基因。结论除Wawasye磁珠试剂盒无法有效去除腐殖酸和黑色素外,两种国产磁珠试剂盒对大多数PCR抑制物均具有良好去除效果。

用于Roche/454高通量测序的12个多重标签转录组文库的构建

利用第二代测序技术测定海洋生物转录组已成为揭示海洋生物分子生物学机制的重要工具.以长度为10nt的不同多重标签(multiplex identifier)进行区分,构建了杂色鲍(Haliotis diversicolor)、僧帽牡蛎(Saccostrea cucullata)和亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)3种海洋生物的12个多重标签转录组文库.以合适的比例对各文库进行混合,利用定量PCR、Qubit和NanoDrop-1000等3种DNA浓度测定方法测定每个多重标签转录组文库的DNA浓度,3种方法的数值均一化并加权平均后,按照预定比例混合.为评估文库质量,先采用传统的Sanger测序测定了混合文库的192条序列,发现191条序列具有符合Roche/454高通量测序要求的AB格式,即一端为454A序列,另一端为454B序列;其中189条序列能分辨出其带有的多重标签;插入的平均长度为348bp.然后通过Roche/454的滴定测序获得了34642条序列,其中32872条序列(94.9%)能分辨出其带有的多重标签,能够精确地分配到12个转录组,并且利用滴定测序结果计算出每个转录组文库的真实比例,对定量PCR、Qubit和NanoDrop-1000进行了评估,结果表明定量PCR是相对准确的定量方法.以上的评估表明所建立的转录组文库构建方法是稳定可靠的,可以广泛应用于转录组学研究.