枯草芽孢杆菌CAB-1抑菌蛋白对黄瓜白粉病的防治作用

采用子叶喷雾法分别测定了枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CAB-1所产抑菌蛋白粗提物对黄瓜白粉病的保护和治疗生物活性。结果表明该抑菌蛋白粗提物能显著降低黄瓜白粉病的病情指数,其保护和治疗作用的效果分别为73.33%和76.85%;EC50分别为175μg.mL-1和125μg.mL-1。利用曲利苯兰染色法检测抑菌蛋白粗提物对黄瓜白粉菌Sphacrotheca fuliginea生长的影响,结果表明该抑菌蛋白粗提物能有效降低白粉菌分生孢子的萌发率及萌发的芽管个数,造成菌丝顶端畸形膨大呈球状并减少新生分生孢子的个数。接菌3 d后,对照的孢子萌发率为36.98%,而经抑菌蛋白粗提物处理后的孢子萌发率仅为4.8%;接菌7 d后对照每个分生孢子梗上串生孢子个数最多为7个,多数5～6个;而抑菌蛋白粗提物处理后每个分生孢子梗上串生孢子个数最多为2个,大部分为1个。

解淀粉芽孢杆菌YN-1抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

本文以解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株为研究对象,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出编码TasA抑菌基因的全长DNA,并构建pGEX-4T2/TasA原核表达载体,获得TasA-GST融合表达的抑菌蛋白。测序结果表明,解淀粉芽孢杆菌YN-1TasA基因核苷酸序列全长为786bp(GenBank登录号:EU131674),编码261个氨基酸残基;同源性分析表明,它与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens FZB42(YP_001421886)序列的同源性最高,达98%,预测蛋白分子量为31kD。SDS-PAGE分析表明,TasA基因能在大肠杆菌BL21中表达,Western印迹分析pGEX-4T2/TasA原核表达载体,检测到约57kD的TasA-GST融合外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。表达产物细胞裂解液上清经Ni柱层析,表明浓度为500mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白。进一步抑菌活性分析表明表达产物对黄瓜灰霉病病原菌检测平板上显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为今后深入研究TasA抑菌蛋白基因以及抗病转基因工程提供了参考。

枯草芽孢杆菌SH7抑菌蛋白的分离纯化及对烟草青枯病菌的抑制作用

采用硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析及聚丙烯凝胶电泳,从枯草芽孢杆菌SH7代谢物中分离纯化出一种相对分子质量为33.6 kD的蛋白,该活性物质具有淀粉酶活力,对烟草青枯病菌具有一定的抑制作用。

枯草芽孢杆菌B9601-Y_2抑菌蛋白活性及产生条件的研究

枯草芽孢杆菌B9601 -Y2 抑菌蛋白可以使棉花红腐病原菌菌丝畸形,呈念珠状,胞壁穿孔,不规则消解,内含物外泄,失活。B9601- Y2 菌株产抑菌蛋白的最适培养条件为:pH 7 0, 37℃培养 48h。菌株的马铃薯蔗糖培养液经 (NH4 )2SO4 至80%饱和度盐析能得到 0 1mg/mL以上的粗蛋白,粗蛋白的产量与培养过程中供氧条件、产菌量呈正相关。粗蛋白能耐80℃高温和pH9 0的碱性,在 4℃下,抑菌活性 60d内基本不变。

新型抑菌蛋白APn5抑制胡萝卜软腐欧文氏菌

【目的】魔芋软腐病是一种由胡萝卜软腐欧文氏菌引起的病害,严重影响了魔芋产业的发展。枯草芽胞杆菌BSn5所产生的蛋白APn5对胡萝卜欧文氏菌具有良好的抑菌效果,本文将对该蛋白进行鉴定和性质分析。【方法】用饱和度为30%的硫酸铵沉淀和超滤离心的方法从枯草芽胞杆菌BSn5的发酵上清液中分离纯化APn5蛋白。以滤纸片法检测APn5蛋白的抑菌谱。用不同的温度、pH条件和蛋白酶处理APn5蛋白,并检测其抑菌活性变化。测定菌株BSn5的生长周期,同步检测其发酵上清液的抑菌活性。利用基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾四极杆飞行时间串联质谱(Q-TOF)分析APn5蛋白。【结果】APn5蛋白对于魔芋软腐病菌具有较好的抑菌活性,抑菌谱较窄,主要对细菌性植物病原菌具有较强的抑制作用;对高温敏感,对蛋白酶E敏感,对蛋白酶K和胰蛋白酶部分敏感;在酸性环境下其抑菌活性稳定,碱性环境下活性不稳定。在菌株BSn5的生长周期中,该蛋白的抑菌活性不能稳定存在,其发酵上清液在对数生长期抑菌活性逐渐升高,进入稳定期后抑菌活性开始下降,直至完全消失。质谱分析未发现其与已知蛋白具有高度相关性。【结论】APn5蛋白具有不同于已报道的枯草芽胞杆菌所产生的抑菌物质的性质,推测为一种新型的抑菌蛋白。

生防枯草芽孢杆菌CAB-1抑菌蛋白产生条件及其稳定性研究

枯草芽孢杆菌CAB-1是一株对番茄灰霉病有显著防效的生防菌株,抑菌蛋白是其产生的主要抑菌物质之一。研究表明,菌株CAB-1产生抑菌蛋白的最佳培养条件为:接种量2%,培养温度30℃,转速180r/min,装液量100 mL/250 mL,培养时间48 h。考马斯亮蓝法测得最佳培养条件下菌株CAB-1产生的粗蛋白浓度为0.16 mg/mL。该粗蛋白对胰蛋白酶及蛋白酶K不敏感,胃蛋白酶处理使其活性降低14%;抑菌蛋白在100℃以下处理30 min活性变化差异不显著,而121℃处理30 min其抑菌活性为对照的72%。抑菌蛋白对酸碱的耐受范围广,在pH值3～12的范围内抑菌活性均能保持在75%以上,pH值2时抑菌活性降低为对照的59%。经甲醇、氯仿、乙醚、乙酸乙酯及丙酮处理后该粗蛋白的抑菌活性变化不大。

枯草芽孢杆菌SH7抑菌蛋白产生的最佳发酵条件及温室防效

枯草芽孢杆菌SH7可抑制烟草青枯病菌的生长,利用硫酸铵沉淀法从发酵液中提取抑菌蛋白质,测定其对烟草青枯病菌抑菌活性,从而确定抑菌蛋白产生的最佳培养基和培养条件。本实验产生抗菌蛋白的最佳培养基为NA液体培养基,最佳发酵条件为:pH6.0,26℃,装液量100mL,170r/min振荡培养96h。粗抑菌蛋白在pH为9.0和10.0时,其抑菌活性仍保持为86%,88%,对碱稳定;在100℃和121℃处理20min,其抑菌活性仍保持为83.1%,68.0%,具有良好的热稳定性。在温室内,抗菌蛋白粗提液对烟草青枯病可取得70.8%的防效。

解淀粉芽胞杆菌JDF-6液态发酵条件优化及抑菌蛋白的分析

为探讨解淀粉芽胞杆菌JDF-6液体发酵条件及抑菌蛋白性质,以菌量和抑菌蛋白粗提液活性为指标,采用单因素和正交试验对菌株的最适发酵培养基成分及发酵条件进行优化,同时通过硫酸铵沉淀法提取抑菌蛋白粗提液,并进行稳定性试验。结果表明,菌株JDF-6最适培养基配比为3.0%蔗糖,1%酵母粉,2%茶渣饼,0.3%硫酸锰;最适发酵条件为发酵时间120 h,发酵温度30℃,初始p H 6.5~7.0,接种量5%,250 m L装液量为100 m L。优化后菌株JDF-6抑菌活性提高51.6%,经50%饱和度硫酸铵沉淀获得的抑菌蛋白的粗提液对蛋白酶、高温(100℃以上)、紫外光(光照8 h以上)敏感,抑菌活性均下降。

短小芽胞杆菌抑菌蛋白TasA基因克隆及功能分析

为了研究短小芽胞杆菌Bacillus pumilus DX01菌株的抑菌相关基因的功能,采用PCR方法从DX01基因组DNA中扩增出编码TasA基因的全长DNA序列,并构建原核表达载体pET2-TasA,在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达获得TasA基因的融合表达蛋白,分别利用悬滴法和平板打饼法检测融合蛋白对玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)分生孢子萌发和对玉米小斑病菌及水稻稻瘟病菌菌丝体生长的抑制活性,结果表明TasA融合蛋白对这2种植物病原真菌的生长有着显著的抑制作用。TasA基因包含1个780bp的完整开放阅读框(GenBank:KC692521),编码259个氨基酸残基;该序列与B.subtilis菌株PEBS2501(GenBank::FJ713581)、B.amyloliquefaciens HF-01(GenBank:JF781312)和B.subtilis菌株BWST7003(GenBank:AP012496)同源抑菌蛋白基因序列相似性达99%。原核表达产物经SDS-PAGE分析检测到约32.3kDa的融合蛋白;经Ni-NTA柱纯化后的融合蛋白对供试病原菌均有显著的抑制作用。经测定发酵液的TasA融合蛋白产率为28μg/mL,短小芽胞杆菌抑菌蛋白TasA基因具有良好的抑菌效果。

番茄灰霉病拮抗菌B26抑菌蛋白的分离纯化与鉴定

根据拮抗菌抑菌圈直径,筛选出对番茄灰霉病菌有强拮抗作用的菌株B26,对该菌株产生的抗菌蛋白进行了初步的分离、纯化和理化性质鉴定。B26发酵液经过离心除去菌体,经50%饱和度的(NH4)2SO4分段透析除盐、DEAE-52离子交换层析、聚乙二醇2000浓缩后纯化出一种抗菌蛋白,该蛋白经SDS-PAGE检测分别由38 080 Da和36 300 Da 2个亚基组成。将该蛋白冷冻干燥后得到一种淡黄色的粉末,即纯化的抗菌蛋白,经初步测定等电点大约为3.5,为一种酸性蛋白。

棉花黄萎病菌拮抗细菌TYG-2抑菌蛋白的分离纯化

拮抗细菌TYG-2是从根际土壤中分离得到的一株芽孢杆菌,其菌株发酵液产生的抑菌物质对棉花黄萎菌具有较强的抑制作用。为了得到它的抑菌活性组分,将TYG-2菌株去菌体发酵液经硫酸铵沉淀,得到的沉淀物脱盐后经DEAE-Sepharose Fast Flow分离得到4个组分,经抑菌活性测定得到一个抑菌活性组分,再通过Sephacry S-100凝胶过滤分离得到两个组分P1和P2,经检测表明P1组分对V.dahliae的菌丝生长具有抑制作用,为有效抑菌活性组分。经SDS-PAGE电泳纯化为单一蛋白带,分子量约为30kDa。

棉花黄萎菌拮抗细菌BDT-25抑菌蛋白的分离纯化

拮抗细菌BDT-25是从根际土壤中分离得到的1株芽孢杆菌,其菌株发酵液产生的抑菌物质对棉花黄萎菌具有较强的抑制作用。为了明确其抑菌活性组分,本研究通过硫酸铵沉淀的方法从BDT-25菌株去菌体发酵液中提取得到对棉花黄萎病菌具有抑制作用的抑菌蛋白,分别采用阴离子交换层析和凝胶过滤层析的方法对其进行了纯化,抑菌活性检测结果显示,P1具有抑菌活性,为有效抑菌活性组分。经SDS-PAGE电泳纯化为单一蛋白带,分子量约为30 kDa。

香蕉枯萎病内生生防菌H4-3抑菌蛋白稳定性研究

铜绿假单胞菌H4-3菌株是福建省农科院农业生物资源研究所微生物研究中心从香蕉植株中分离到的内生菌,该菌株对香蕉枯萎病原菌具有很强的抑菌活性,其活性物质为大分子蛋白。研究测定了H4-3菌株抑菌蛋白的稳定性,结果表明:H4-3菌株的抑菌蛋白耐高温、强酸、强碱和高浓度蛋白酶,紫外线和反复冻融对H4-3菌株抑菌蛋白活性无显著影响。

拮抗水霉菌株的筛选及抑菌蛋白的分离纯化

水霉病是一种广泛存在于水体中的真菌性病原菌,无寄主选择性,目前渔业生产上主要依赖化学药物防治,导致病原菌的抗药性增强.本研究通过平板对峙培养法,筛选到5株具有拮抗活性的菌株.通过硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶和离子交换树脂等方式进行分离纯化,从Bacillus subtilis strain TCCC11201发酵液中分离得到一个对水霉病菌具有抑制活性的蛋白,经SDS-PAGE电泳检测,其相对分子质量为2×104.菌株TCCC 11201代谢产生的活性蛋白具有防治水霉病的潜在应用价值.

褐杆菌L2的抑菌活性与抑菌蛋白研究

褐杆菌属细菌的多个种均具有较强的抑菌活性。本实验室分离到一株褐杆菌属细菌L2,经16SrRNA基因序列测定与分析,菌株L2与抑菌褐杆菌(Phaeobacter inhibens)DSM 16374T相似性为99.86%,亲缘关系最近;采用牛津杯法测定菌株L2的抑菌谱,L2可以显著抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌和芽胞杆菌的生长,且在培养72h后抑菌活性最强;对菌株L2的胞外蛋白进行胶内活性检测,确定了具有抑菌活性的蛋白条带,质谱测序分析结果显示菌株L2的抑菌蛋白与金丽假交替单胞菌JG1分泌的抑菌蛋白的相似性为29.8%,推测其为一种L-氨基酸氧化酶。本研究为进一步将菌株L2及其活性产物应用奠定了基础。

枯草芽孢杆菌体外抑菌试验及其抑菌蛋白的鉴定

旨在深入研究枯草芽孢杆菌发挥抑菌作用的相关抑菌蛋白,进一步了解枯草芽孢杆菌抑菌机制。本研究以枯草芽孢杆菌GX20200511-1株为研究对象,采用体外共培养及牛津杯法测定体外抑菌活性,低温离心和超滤法初步分离枯草芽孢杆菌的胞外蛋白,利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进一步分析鉴定枯草芽孢杆菌发酵产物中的抑菌成分。结果表明枯草芽孢杆菌GX20200511-1对沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抑菌效果,显著降低共培养24 h后的指示菌数量。经LC-MS/MS鉴定分析,共检索出455种蛋白质,通过Uniprot蛋白数据库对所有蛋白质进行分析,检测出6种可信度较高且与抑菌作用相关的蛋白质,分别是壳聚糖酶(chitosanase)、聚酮生物合成3-羟基-3-甲基戊二酰ACP合成酶PksG(polyketide biosynthesis 3-hydroxy-3-methylglutaryl-ACP synthase PksG)、伊枯草菌素合成酶(iturin synthetase)、表面活性素合成酶(surfactin synthetase)、丰原素合成酶(fengycin synthetase)和tRNA核酸酶WapA(tRNA nuclease WapA),分子量分别为31.395、46.766、296.6、402.43、48.86和173.525 kDa。本研究枯草芽孢杆菌GX20200511-1可能通过代谢产物中的多种抑菌蛋白协同发挥抗菌作用。

解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白研究进展

解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloiquefaciens)具有广泛的抑菌活性.在种植业、养殖业、果蔬采后病害防治、环保、食品安全等领域具有广泛应用前景,其菌体能产生多种抑菌蛋白.目前,国内外对解淀粉芽胞杆菌抑菌蛋白的研究逐渐深入.综述了解淀粉芽胞杆菌抑菌蛋白的研究,其中包括解淀粉芽孢杆菌菌株的生境多样性,解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌蛋白种类和作用效果,抑菌蛋白提取、纯化、鉴定及其初步的作用机制,以期对解淀粉芽孢杆菌的抑菌蛋白研究、应用及开发提供科学参考.

植物乳杆菌抑菌蛋白的分离鉴定及抑菌特性研究

【目的】筛选新型广谱有效的抑菌蛋白,为全面解析植物乳杆菌抑菌机制和开发新型抗菌制剂奠定基础。【方法】以植物乳杆菌GX20200417-1为研究对象,采用牛津杯法测定其抑菌活性,以低温离心和超滤法初步分离获得胞外蛋白并测定其抑菌活性,对胞外蛋白进行不同温度、pH及蛋白酶处理,研究抑菌蛋白理化特性,利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进一步分析鉴定植物乳杆菌代谢产物中的抑菌成分。【结果】植物乳杆菌GX20200417-1对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抑菌作用;发酵上清液在发酵24 h的抑菌能力最强;胞外蛋白的抑菌能力与发酵上清液相近;植物乳杆菌抑菌蛋白具有较好的耐热特性,与对照组相比,在20~80℃时抑菌活性均无显著变化(P<0.05),在pH 6.0~8.0时抑菌活性最佳,对蛋白酶敏感;经LC-MS/MS鉴定分析,检测出5种可信度较高且与抑菌作用相关的蛋白质,分别是片球菌素pediocin PA-1、溶菌素(lysin)、聚酮合酶(polyketide synthase)、辅助蛋白(accessory protein)和LysM peptidoglycan-binding domain-containing protein,分子质量分别为5.348、7.348、8.348、6.348和19.662 ku;蛋白质功能分析结果表明,片球菌素pediocin PA-1与溶菌素主要通过破坏细菌细胞壁与细胞膜,从而达到抑菌效果。LysM peptidoglycan-binding domain-containing protein可识别含有N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基的肽聚糖,上调抗菌肽的表达;辅助蛋白主要参与细菌素的合成,聚酮合酶主要参与抗生素的合成,二者通过参与抑菌物质的合成间接发挥抑菌作用。【结论】本研究成功分离并鉴定植物乳杆菌GX20200417-1的5种抑菌蛋白;植物乳杆菌GX20200417-1可能通过其代谢产物中的多种抑菌蛋白协同发挥抗菌作用。

枯草芽胞杆菌XF-1粗蛋白抑菌活性初步研究

枯草芽胞杆菌XF-1是一株对大白菜根肿病有良好防治效果及对多种植物病原真菌有抑菌效果的生防菌株。为了研究其可能的作用机制,本文用硫酸铵沉淀法提取了发酵液中粗蛋白,并在不同处理条件下对其抑菌活性进行了初步研究。该粗蛋白对蛋白酶K和胰蛋白酶及紫外照射均不敏感,对热稳定。经40、60、80℃和100℃处理20 min后,其抑菌作用基本上无变化;经121℃处理20 min后,抑菌活性保持60%。这些结果,为进一步研究XF-1菌株对根肿病的防治机制和进一步应用提供了试验依据。

产抑菌蛋白的丁酸梭菌的筛选和鉴定及体外益生功能研究

试验旨在筛选产高效抑菌蛋白的丁酸梭菌,并研究其体外生物学特性,为其在动物生产中的应用奠定基础。采用厌氧培养法进行菌种分离,孔穴琼脂扩散法进行抑菌活性筛选,并通过形态学、生理生化特性和16S r DNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定。选取丁酸梭菌ZJU-1进行体外抗逆性和益生功能研究,采用试剂盒进行酶活测定,顶空-气相色谱发测定挥发性脂肪酸。结果表明:从盲肠内容物中分离到6株丁酸梭菌,其中3株菌种对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌ATCC25923均具有明显抑制作用。目标菌株ZJU-F1经鉴定结果为丁酸梭菌。丁酸梭菌ZJU-F1具有较好人工胃液、人工肠液、胆盐和抗生素耐受性;分泌淀粉酶和蛋白酶,活性分别达2 515.43 U/m L和93.72 U/m L;并具有分泌挥发性脂肪酸的功能,其中乙酸和丁酸的分泌量分别达2.29 g/L和1.87g/L。本试验获得的丁酸梭菌ZJU-F1具有较强的抗逆性和益生功能,作为潜在的抗生素替代物具有巨大的开发利用价值.