抗人乳头瘤病毒16型E6基因核酶对宫颈癌CaSKi细胞生长和端粒酶活性的影响

目的研究抗HPV16E6核酶(Ribozyme)对宫颈癌CaSKi细胞生长和端粒酶活性的影响。方法以脂质体法将抗HPV16E6-Ribozyme、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R和CaSKi-P细胞。点杂交检测核酶在细胞中的表达,northern杂交检测三种细胞中E6基因的表达;细胞生长曲线检测细胞生长的改变;TRAP-Elisa法检测端粒酶活性。结果点杂交证实核酶能在CaSKi-R细胞中稳定表达,northern杂交证实CaSKi-R中表达E6较CaSKi-P和CaSKi明显降低。CaSKi-R细胞生长速度较CaSKi-P和CaSKi明显减慢(P<0.01);CaSKi,CaSKi-P和CaSKi-R三种细胞的端粒酶活性分别为0.89±0.14,0.90±0.11,0.36±0.06,转染了抗HPV16E6核酶的CaSKi-R的端粒酶活性的抑制率为59.55%。经统计学处理,CaSKi-R的端粒酶活性较CaSKi和CaSKi-P细胞明显下降(P<0.01)。结论转染抗HPV16E6-Ribozyme的CaSKi-R细胞出现一定程度的生长抑制,端粒酶活性较前明显下降。

新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中乳头瘤病毒16型E6基因的克隆和序列分析

为了分析新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV16型E6基因结构特点 ,从中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取DNA ,以宫颈癌活检组织标本DNA为模板进行PCR扩增 ,获得HPV16E6基因 ,将其克隆到pUCm T载体上 ,并对其进行基因全序列分析 .PCR检测结果显示宫颈癌组织中HPV16E6阳性率为 82 35 % (14/17) ;测序结果显示 ,新疆株HPV16E6基因全长 45 6bp ,大小与德国标准株一致 .E6基因的第 2 47位碱基发生T→G突变 ,并由此引起所编码的氨基酸亦发生改变 .上述结果表明 ,中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌患者组织中HPV16E6的基因结构与德国标准株HPV16E6基因之间存在差异 .

宫颈癌患者人乳头瘤病毒16型E6基因的克隆及序列分析

目的 分析中国陕西地区宫颈癌患者人乳头瘤病毒 16型 (HPV16型 )E6基因的结构特点。方法 采用PCR技术扩增了 1例HPV16阳性宫颈癌患者癌组织中HPV16E6基因 ,并对其进行了克隆及全序列分析。结果 成功地克隆了HPV16E6基因 ,与GenBank收录的原型相比 ,E6基因中有 2个碱基发生突变 ,推导其编码的氨基酸有 1个发生了变化。

人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强

利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒 16型 (humanpapillomavirustype16 ,HPV16 )E6E7融合基因 (fmE6E7) ,研制治疗HPV16相关疾病的DNA疫苗。用PCR扩增fmE6E7基因后 ,插入真核表达质粒获得pVR10 12 fmE6E7,瞬时转染Cos 7细胞 ,免疫荧光法检测证实其表达后 ,在C5 7BL 6小鼠后腿肌肉进行裸DNA免疫 ,5 1Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性 (cytotoxicTlymphocyte,CTL) ,间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体。研究表明修饰后的中国地方株E6E7融合基因可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应 ,与单独野生型E7基因免疫相比 ,E6E7融和基因可更好的活化CTL反应。表明修饰后消除转化活性的中国地方株E6E7融合基因可作为HPV16治疗性DNA疫苗的靶基因。

新疆哈萨克族食管癌组织中乳头瘤病毒16型E6E7基因的研究

为了解HPV16感染后E6E7基因变化在哈萨克族食管癌发病中的作用 ,以及HPV16E6E7基因与食管癌病理组织分级的关系 ,采用聚合酶链 (PCR)技术 ,检测 82例食管癌及癌旁正常食管粘膜组织中HPV 16E6E7基因差别。食管癌、癌旁正常粘膜组HPV16E6E7基因的检出率分别为 3 4. 15 % ( 14 /4 1)和 19. 5 1% ( 8/4 1) ,63 . 41% ( 2 6/4 1)和48. 78% ( 2 0 /4 1) ,差别均无显著性 (P >0 . 0 5 )。然而 ,在食管癌组织的高分化组、中低分化组中HPV16E6E7的检出率分别为 7. 69% ( 1/13 )和 46. 43 % ( 13 /2 8) ,3 8. 46% ( 5 /13 )和 75 % ( 2 1/2 8) ,差别均有统计学意义 (P <0 .0 5 )。提示HPV16E6E7基因与哈萨克族食管癌的发生及癌组织分级密切相关。

雌激素对人乳头状瘤病毒16型E6基因转染人永生化表皮细胞效率的影响

目的:探讨雌激素对人乳头状瘤病毒16(HPV 16)型E6基因转染人永生化表皮细胞效率的影响。方法:以不同浓度的17-β-雌二醇(E_2)处理人永生化表皮细胞系(Ha Cat)后,绘制其生长曲线,以细胞活性测定法(MTT)测定细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期分布,溴脱氧尿嘧啶核苷法(Brd U)测定细胞周期时相。脂质体转染法将含HPV 16 E6基因的质粒转染入经不同药物处理后的细胞中,以Real-time PCR法测定细胞中该基因的表达。结果:浓度为10^(-7)~10^(-5) mol/L的E_2促进细胞数目的增加(P<0.05);浓度为10^(-8)~10^(-6) mol/L的E_2明显增强细胞活性(P<0.05);浓度为10^(-7)~10^(-5) mol/L的E_2使Ha Cat细胞的细胞周期时相缩短(P<0.05);不同浓度E_2处理组细胞周期的分布差异无统计学意义(P>0.05)。当Ha Cat细胞被HPV 16E6质粒转染,随着E_2浓度的增加,HPV 16 E6 m RNA表达明显增加(P<0.05)。结论:E_2可加速Ha Cat细胞生长与增殖,增加HPV 16 E6转染Ha Cat细胞的效率,E_2水平升高可能增加HPV感染的风险。

人乳头瘤病毒16型(新疆株)E6基因的原核表达

根据人乳头瘤病毒 16 (新疆株 ) E6基因编码序列设计引物 ,从含有 HPV16 E6基因的质粒中扩增出含 HPV16 E6基因的 DNA片段 ,该片段全长 4 5 0 bp,将所得片段与 p MD18- T载体连接 ,转化到 JM10 9大肠杆菌中 ,筛选的阳性克隆扩增后 ,提取质粒 DNA,用 Bam H I和 Sal I酶切 ,回收 4 5 0 bp的目的片段 ,定向克隆到 p ET2 8a中 ,转化 JM10 9受体菌 ,从 JM10 9受体菌中提出质粒 ,再转化到 BL2 1(DE3)中 ,筛选出转化体 ,用 IPTG诱导表达 ,在 PAGE上见到所表达的18k D的特异性的 HPV16 (新疆株 ) E6蛋白条带。

人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

背景与目的:人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirus16,HPV16)的早期基因E6、E7可分别诱导p53的泛素化降解和pRb的高磷酸化失活,与宫颈癌的发生发展关系密切。本研究通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达,探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡。方法:利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞,利用RT-PCR和Westernblot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化,利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况。结果:转染携带HPV16型E6、E7反义基因的质粒后,SiHa细胞的E6、E7基因的mRNA和蛋白表达均明显下调;MTT结果显示转染后细胞的增殖活性(0.50±0.05)与转染空载体细胞(1.01±0.06)和未转染细胞(1.28±0.06)比较明显降低(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示转染后细胞凋亡率(59.3±11.3)%与转染空载体细胞(9.4±1.8)%和未转染细胞(2.1±0.4)%比较有显著性差异(P<0.05)。激光共聚焦显微镜结果示转染后细胞凋亡明显增多。结论:HPV16型E6、E7基因反义RNA可降低宫颈癌细胞中E6、E7癌基因的表达,诱导宫颈癌细胞凋亡。

人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达，探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡。利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞。利用RT-PCR和Western blot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化，利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性，利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况。

宫颈癌患者HPV16型E6蛋白的表达纯化及血清抗体检测

背景与目的:人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)是宫颈癌组织中最常见的高危HPV,其相应蛋白的血清抗体与宫颈癌的发生发展相关。本研究构建HPV16E6重组表达载体并表达纯化获得HPV16E6重组蛋白,用于检测不同人群血清相应抗体,初步探讨本地区HPV16E6血清抗体反应与宫颈癌的相关性。方法:将HPV16E6基因与pRSET-A融合表达载体连接,获得E6表达重组体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用异丙基硫代-$-D-半乳糖苷(isopropylthio-$-D-galactoside,IPTG)诱导表达。表达的包涵体变性后经Ni柱纯化,复性并经活性鉴定后,用以包被ELISA板,检测正常女性、慢性宫颈炎患者和宫颈癌患者血清抗体。同时采用荧光偏振方法分型检测宫颈癌组织HPVDNA。结果:pRSET-16E6表达重组体的工程菌经IPTG诱导后可表达Mr24×103的HPV16E6组氨酸融合蛋白,表达量占菌体蛋白的22.3%。表达形式为包涵体,重组蛋白纯度达95%以上,其活性经ELISA法证实。80例正常女性、46例慢性宫颈炎和32例宫颈癌患者血清抗体阳性率分别为5.0%、6.5%和31.2%,宫颈癌患者HPV16E6血清抗体阳性率显著高于正常人(P<0.002)及慢性宫颈炎患者(P<0.01),而正常人与慢性宫颈炎患者间的差异无显著性。32例宫颈癌患者癌组织中,HPVDNA阳性率90.6%,HPV16DNA阳性率46.9%。HPV16DNA阳性组血清HPV16E6抗体阳性率(46.7%)高于阴性组(17.6%),但两组间的差异无显著性(P>0.05)。结论:在pRSET-A/BL21中表达获得的HPV16E6融合蛋白,可用于宫颈癌相关HPV的血清学研究;宫颈癌患者HPV16E6血清抗体阳性率明显高于正常人和慢性宫颈炎患者。

HPV16、18型E6/E7融合基因痘苗病毒表达载体的构建

目的:构建一种含人乳头瘤病毒(HPV)16型、18型E6/E7融合基因痘苗病毒表达载体。方法:PCR扩增HPV16型、18型E6、E7基因,克隆到pSC-A载体中,通过定点突变方法,分别构建成含E6/E7融合基因的质粒,即pSC-A-HPV16 E6/E7和pSC-A-HPV18 mE6/E7,并将二者连接成载体pSC-A-HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7(pSC-T,HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7:T),最后以痘苗病毒表达载体pJ38为转移载体,构建质粒pJ38-HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7(pJ38-T),对所有重组质粒进行酶切鉴定和测序分析。结果:E6/E7融合基因成功克隆到pJ38上。结论:成功构建表达HPV E6/E7融合基因重组痘苗病毒载体,为研制宫颈癌治疗性疫苗奠定基础。

宫颈癌组织中HPV16型E6/E7序列突变分析

目的分析泉州地区宫颈癌患者HPV16型E6/E7序列突变情况,探讨其与宫颈癌发生的相关性。方法取35例HPV16阳性的宫颈癌组织标本,采用PCR法扩增E6、E7全长基因。PCR产物直接测序,并与野生型序列进行比对。分析E6、E7基因的变异情况。结果 E6、E7基因的突变率分别为91.4%和89.2%。E6基因中有10个位点为错义突变,2个位点为无义突变。氨基酸突变频率最高的是D25E(77.1%)。E7基因中共发现5个突变位点,有2个位点为错义突变,3个位点为无义突变,突变频率最高是N29S和无义突变T846C(均为75.0%)。结论 HPV16E6、E7基因中最常见突变位点D25E、N29S和T846C可能与宫颈癌的发生密切相关,可为研究针对中国人群的HPV疫苗提供一定的线索。

HPV16 E6,E7基因与宫颈疾病及其癌变的关系

目的 研究人乳头状瘤病毒 1 6型 (HPV1 6 )E6 /E7基因在宫颈疾病及其癌变中的作用。方法 运用PCR的方法扩增HPV1 6E6 /E7基因 ,分子克隆技术进行基因的克隆并进行基因序列的测定 ,病理学的方法确诊宫颈炎、CINⅡ～Ⅲ级和宫颈癌。结果 宫颈癌 ,CINⅡ～Ⅲ级 ,宫颈炎组织中HPV1 6E6 /E7总检出率分别为 70 % ,75 %和 6 5 %。其中HPV1 6E7的检出率在三者之间差异无显著性 ,HPV1 6E6的检出率在宫颈癌与CINⅡ～Ⅲ级之间差异无显著性 ,但两者都高于宫颈炎。结论 HPV1 6E6 /E7基因与宫颈疾病及其癌变的关系密切 ,在宫颈疾病的癌变过程中 ,E6基因可能发挥了重要的作用。

HPV16/18E_6和P_(53)基因蛋白在喉鳞癌中的表达及其相关性研究

目的 探讨人乳头瘤病毒16 / 18型早期蛋白E6 (HPV16 / 18E6 )、P53基因蛋白在喉鳞癌(L SCC)中的表达及其相关性。方法 免疫组化SABC法检测HPV16 / 18E6 和P53基因蛋白在L SCC及声带息肉中的表达。结果 HPV16 / 18E6 在声带息肉中未见表达,在L SCC中的表达率为4 0 .0 % ,差异有显著性(P <0 .0 5 )。P53基因蛋白在声带息肉与L SCC中的表达率分别为6 .6 6 %和6 6 .2 % ,差异有显著性(P <0 .0 5 )。HPV16 / 18E6 及P53基因蛋白的表达与L SCC临床分期、淋巴结转移有关。二者的表达无明显相关性。结论 HPV 16 / 18型感染和P53基因异常与L SCC发生、发展有关。HPV16 / 18E6 与P53基因功能异常无明显相关性。

新疆哈萨克族食管癌患者HPV16 E6基因的克隆及序列分析

目的:分析新疆地区哈萨克族食管癌患者人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6基因结构的特点。方法:采用PCR技术扩增食管癌患者HPV16E6基因,其中18例哈萨克族食管癌中8例阳性,阳性率为44.4%,并对其进行了克隆及全序列分析。结果:克隆了哈萨克族食管癌HPV16E6基因,与Genebank(AF536179.1)收录的德国株相比,E6基因中氨基酸发生了变化。结论:新疆哈萨克族食管癌HPV16E6基因有一定的变异。

宫颈癌组织中HPV16 E6基因的检测及其意义

目的 探讨宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒 16型 (HPV16)E6基因的检测及其意义。方法 运用PCR方法扩增HPV16E6/E7基因 ,分子克隆技术进行基因的克隆后进一步测定基因序列 ,宫颈炎和宫颈癌的确诊依赖于病理学方法。结果 宫颈癌组织中HPV16E6基因的检出率为 45 % ,显著高于宫颈炎组织中 5 %的检出率 ,两者有统计学差异。HPV16E7基因的检出率在两者之间没有显著性差异。结论 HPV16E6基因在宫颈癌的发病中起到重要的作用。宫颈组织中HPV16E6基因的检测有望成为宫颈癌筛查的新手段。

人乳头瘤病毒16型E6E7癌基因对结肠癌细胞周期和增殖的影响

目的检测和分析人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7癌基因对结肠癌细胞增殖状况和细胞周期的影响。方法运用含有HPV16E6E7癌基因的重组腺伴随病毒(rAAVE6E7)感染HCT116和SW480结肠癌细胞株,应用流式细胞术检测感染效率,Westernblot法检测HPV16E6癌蛋白的表达。MTT法和流式细胞技术分别检测感染前后结肠癌细胞的增殖状况和细胞周期。结果rAAVE6E7感染结肠癌细胞后24h开始可以检测到HPV16E6癌蛋白的表达,未感染的细胞不表达HPV16E6蛋白。rAAVE6E7感染后,HCT116细胞群体倍增时间缩短为对照组的68.42%,OD540值升高47.48%,G0/G1期细胞比例下降,S期细胞比例增高。SW480细胞群体倍增时间缩短为对照组的77.06%、OD540值升高47.18%。结论高危型HPV的E6E7癌基因能够促进结肠细胞的增殖、干扰其细胞周期,有可能在结直肠癌的发生、发展过程中发挥作用。

共表达HPV16型E6和E7突变基因重组痘苗病毒的构建及其抗肿瘤免疫效果的观察

目的 构建用于子宫颈癌治疗的HPV16型E6和E7重组痘苗病毒实验性疫苗株 ,并对其抗肿瘤免疫效果进行初步评价。方法 以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术构建共表达HPV16E6和E7基因的重组痘苗病毒。该病毒免疫C57BL 6小鼠后 ,检测其免疫原性和抗移植瘤生长情况。结果 PCR结果显示 ,重组病毒VmE6E7的TK基因内插入了分别由痘苗病毒早晚期启动子H6和7.5K表达的ME6和ME7 1基因。动物实验结果表明 ,rVmE6E7在C57BL 6小鼠体内可诱发E6和E7特异性抗体产生 ,被免疫小鼠能够抵抗HPV16E6E7转化的同系肿瘤细胞的攻击。结论 获得 1株用于宫颈癌治疗的HPV16型实验疫苗株 ,为进一步研制人用HPV16型疫苗株奠定了基础。

慢病毒介导的人乳头瘤病毒16型E6基因shRNA对荷瘤裸鼠宫颈癌生长的抑制作用

目的探讨慢病毒介导的人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)16型E6基因shRNA在体内对荷瘤裸鼠宫颈癌生长的抑制作用。方法将BALB/c-nu裸鼠随机分为空白对照组、干扰组和无义干扰组,经皮下接种宫颈癌Caski细胞(2×106个),移植瘤直径达0.5 cm时,空白对照组于瘤体局部注射PBS,干扰组和无义干扰组分别于瘤体局部注射靶向HPV16型E6基因的shRNA-PLL3.7干扰慢病毒和无义干扰慢病毒(3×108TU/ml),2周后检测瘤体大小和重量的变化,采用免疫组化法检测肿瘤组织中HPV16型E6、P53和P21蛋白的表达。结果与无义干扰组和空白对照组比较,干扰组裸鼠体内肿瘤明显缩小,瘤体重量明显降低(P<0.000 1),无义干扰组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);干扰组肿瘤组织中HPV16型E6蛋白的表达被抑制,P53和P21蛋白的表达水平明显升高。结论慢病毒介导的HPV16型E6基因shRNA能有效抑制动物体内宫颈癌的生长,具有潜在的开发应用前景。