抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体介导的αβT细胞CDR3谱系漂移

目的探讨抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体(BHL-1)介导的αβT细胞CDR3谱系漂移,为双特异性抗体介导的T细胞免疫应答机制提供理论基础。方法采用免疫扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员T细胞在人卵巢癌SKOV3细胞联合BHL-1刺激前后的TCR库多样性变化(CDR3谱型分布特征)及刺激后T细胞TCRα、β链CDR3优势利用情况,对克隆性增生T细胞的CDR3区进行序列分析。结果刺激前6例正常献血员TCR CDR3谱型均呈高斯分布,刺激后发生CDR3谱系漂移,部分TCR Vα、Vβ家族出现优势增生,明确了BHL-1介导下单克隆增生T细胞的α、β链CDR3序列。结论 SKOV3联合BHL-1诱导的T细胞CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达可能与BHL-1介导的特异性T细胞免疫反应有关,特异应答T细胞TCR CDR3序列的确定,将为卵巢癌的T细胞免疫治疗提供基础。

抗人卵巢癌×抗人CD3双特异性单链抗体的构建、表达及复性研究

构建了抗人卵巢癌×抗人CD3双特异性单链抗体 (scBsAb) ,在大肠杆菌中得到表达。用稀释复性 ,缓慢透析复性和凝胶过滤层析复性三种方法对scBsAb表达形成的包涵体进行复性研究表明 ,凝胶过滤层析复性能有效抑制蛋白的聚集。ELISA检测显示 ,复性后的scBsAb具有较高活性 ,能与相应抗原特异结合。

抗人卵巢癌COC183B2/抗CD3单链双特异抗体的构建和表达

目的 :构建和表达一种可与卵巢癌细胞和淋巴细胞结合的双特异抗体。方法 :利用PCR分别扩增抗人CD3单链抗体 (singlechainvariablefragment,ScFv)重链可变区 (variableregionoftheheavychain ,VH)和轻链可变区 (variableregionofthelightchain ,VL) ,重组抗人CD3ScFv ,经测序后将其克隆入有链间连接肽基因序列的载体pALM中 ,再将抗人卵巢癌COC183B2ScFv克隆至紧邻链间连接肽前形成COC183B2 /抗CD3单链双特异抗体(single-chainbispecificantibody ,scBsAb)的重组。最后将COC183B2 /抗CD3scBsAb克隆入表达载体 pTMFC中进行表达 ,同时分别表达抗人卵巢癌单抗COC183B2和抗人CD3单抗的ScFv作为对照组。用ELISA、流式细胞学方法和玫瑰花环实验对scBsAb进行免疫学活性测定。结果 :成功构建抗人卵巢癌COC183B2 /抗CD3scBsAb ;其表达的蛋白链相对分子质量约 6 0 ;ELISA结果显示scBsAb可与抗原OC183B2结合 ,流式细胞学结果显示scBsAb可与抗原CD3结合 ,花环实验显示scBsAb在体外可引导效应细胞聚集在靶细胞周围。结论 :构建和表达抗人卵巢癌COC183B2 /抗CD3scBsAb成功 ,且具有与抗原OC183B2。

抗人卵巢癌-抗人CD3单链双特异性抗体体外介导的细胞毒作用及其机制

目的了解抗人卵巢癌-抗人CD3（BHL—I）单链双特异性抗体（scBsAb）体外介导的外周血淋巴细胞（PBL）对靶细胞SKOV3的细胞毒作用及可能的机制。方法二苯基溴化四氮唑蓝（MTr）法检测BHL-I体外介导PBL对SKOV3细胞的杀伤作用；逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测BHL—I介导的细胞毒作用过程中效应细胞PBL对穿孔素（perforin）、颗粒酶（GrB）mRNA表达的影响；酶联免疫吸附（ELISA）法检测细胞培养上清液中人肿瘤坏死因子-α（hTNF—α）和人干扰素-γ（hIFN-γ）含量的变化。结果BHL-I体外介导PBL对SKOV3细胞的细胞毒作用显著高于对MCF-7细胞的作用（P〈0.01），并且在效靶比为12．5：1、作用时间为36h、BHL-I浓度为25μg/ml时，PBL对靶细胞的细胞毒作用最为显著；BHL—I体外介导的细胞毒作用中，PBL表达perforin、GrBmRNA及混合细胞培养上清液中hTNF—α和hIFN-γ的含量均显著升高，并且白介素2（IL-2）的存在有利于这些因子的表达。结论BHL—I介导PBL对靶细胞的细胞毒作用具有一定的特异性，并且IL-2能增强BHL—I介导PBL的细胞毒作用。

抗前列腺癌/抗CD3双特异性单链抗体的构建及表达

目的 构建并表达抗前列腺癌 /抗人CD 3双特异性单链抗体 ,观察其生物学活性及临床意义。方法 利用PCR方法及分子生物学基因克隆技术 ,构建抗前列腺癌 /抗人CD 3双特异性单链抗体融合基因 ,测序正确后 ,利用EcoRI和HindⅢ酶切位点 ,将融合基因亚克隆入真核表达载体进行表达 ,表达产物纯化后 ,利用流式细胞仪进行生物学活性测定。结果 经酶切、测序分析证实插入的基因片段大小为 1 5kb ,序列与设计完全一致 ;SDS PAGE和Western印迹实验证明 :表达产物分泌于细胞培养上清 ,相对分子质量为 6 10 0 0 ;流式细胞仪结果显示 :双特异性单链抗体与PBMC和PC 3细胞的阳性结合率分别为 5 4 1%和 5 3 7%。结论 抗前列腺癌 /抗人CD 3双特异性单链抗体具有较好的生物学活性 ,为进一步的体内实验奠定了基础。

多价抗人精浆蛋白/抗人CD_3双特异性单链抗体的构建及表达

目的 构建多价抗人精浆蛋白 (γ Sm) /抗人CD3 双特异性单链抗体 (scFv)基因 ,并进行真核表达和活性测定。 方法 利用递归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p5 3四聚功能域融合基因 ,克隆入pUC1 9载体中构建pUC1 9/IgG3/p5 3克隆载体。将抗人CD3 scFv(CD3 scFv)和抗人γ SmscFv(γ SmscFv)依次克隆入pUC1 9/IgG3/p5 3载体中 ,构建多价双特异性γ SmscFv/CD3 scFv[scFv2 (CD3 /γ Sm) ]融合基因。将融合基因克隆入真核表达载体pSecTag2 B中 ,转染HeLa细胞进行表达 ,表达产物纯化后流式细胞仪进行活性测定。 结果 获得了多价scFv2 (CD3 /γ Sm)融合基因 ,基因全长 1 6 38bp ,可编码 5 4 6个氨基酸 ,与已发表的γ SmscFv、CD3 scFv和人p5 3四聚功能域基因cDNA序列一致。表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约 6 70 0 0的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞和人外周血单个核细胞 (PBMC) ,亲和力高于双特异性scFv。 结论 获得了可与PBMC和PC 3细胞特异结合的多价scFv2 (CD3 /γ Sm) 。

抗前列腺特异抗原航CD3双特异性单链抗体四聚体的制备

本实验旨在构建人IgG3上游铰链区／p53四价功能域融合基因和抗前列腺特异抗原／抗CD3双特异性单链抗体的基础之上，进一步制备该双特异性单链抗体的四聚体。