抗人有机阴离子转运蛋白4多克隆抗体的制备及其在肾脏的定位研究

目的:拟采用一套新的基因免疫系统制备高特异性和高效价的小鼠抗有机阴离子转运蛋白4(hOAT4 )多克隆抗体,并用该抗体对hOAT4在人肾小管上皮细胞的表达进行定位研究。方法:应用Accelrys软件分析hOAT4抗原表位,选择其中免疫源性较强的细胞内表位(E2 78～R345 ) ,从人肾组织总RNA中用反转录-聚合酶链反应(RT -PCR)方法扩增其2 0 4bp的cDNA序列,克隆到pBQAP -OVA构建基因免疫载体,鉴定正确后与辅助载体pCMVi-GMCSF和pCMVi -FlT3L同时免疫小鼠,5周后取血清抗体,ELISA方法测定抗体滴度,人肾组织Westernblot和免疫组化鉴定抗体的特异性和定位表达。结果:成功构建基因免疫载体pBQAP -OVA -hOAT4 ,经酶切及序列分析鉴定完全正确。ELISA方法测得抗体滴度高达1∶30 0 0 ,该抗体识别人肾皮质膜蛋白和肾小管刷状缘蛋白6 5kD糖基化的hOAT4。人肾组织免疫组化结果提示该抗体识别定位在近段肾小管上皮细胞刷状缘的hOAT4。结论:用基因免疫方法可以成功制备高效价和高特异性抗hOAT4多克隆抗体。

胆绿素还原酶A rs699512和肝细胞溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1B1 rs4149015位点基因多态性与新生儿不明原因高胆红素血症易感性相关性研究

目的:分析胆绿素还原酶A(BLVRA)rs699512和肝细胞溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1B1(SLCO1B1)rs4149015位点基因多态性与新生儿不明原因高胆红素血症(HB)易感性的相关性。方法:选取不明原因HB新生儿90例为HB组,另选取同期健康新生儿90例为对照组。比较两组临床资料以及BLVRA rs699512、SLCO1B1 rs4149015位点基因型分布和等位基因频率。比较不同BLVRA rs699512、BLVRA rs699512基因型患儿血清胆红素水平。分析BLVRA rs699512、SLCO1B1 rs4149015位点基因多态性与HB易感性的关系。结果:HB组患儿总胆红素和结合胆红素水平明显高于对照组(均P<0.05)。两组BLVRA rs699512、SLCO1B1 rs4149015位点基因型分布比较差异有统计学意义(均P<0.05)。HB组患儿BLVRA rs699512位点GG基因型分布高于对照组,AA基因型分布低于对照组,G等位基因频率高于对照组(均P<0.05)。HB组患儿SLCO1B1 rs4149015位点AA基因型分布高于对照组,GG基因型分布低于对照组,A等位基因频率高于对照组(均P<0.05)。BLVRA rs699512中GG基因型总胆红素和结合胆红素水平高于AA基因型(均P<0.05)。SLCO1B1 rs4149015中AA基因型总胆红素和结合胆红素水平均高于GG基因型(均P<0.05)。BLVRA rs699512位点GG基因型与HB发生呈正相关,AA基因型与HB发生呈负相关(r=0.671、-0.608,均P<0.05)。SLCO1B1 rs4149015位点AA基因型与HB发生呈正相关,GG基因型与HB发生呈负相关(r=0.695、-0.633,均P<0.05)。结论:不明原因HB新生儿BLVRA rs699512位点GG基因型与SLCO1B1 rs4149015位点AA基因型会增加易感性,临床可建立早期防治体系以改善患儿预后。

高脂及劳倦伤脾大鼠有机阴离子转运肽oatp4a1 mRNA及蛋白表达

目的观察有机阴离子转运肽oatp4a1在脾虚模型大鼠各组织中的表达。探讨其在水液湿浊转运中的作用机制。方法选取6只SPF级大鼠制备劳倦伤脾模型,另选取12只大鼠随机分为空白对照组(空白组)、高脂饮食组(高脂组),每组6只。劳倦伤脾模型组(劳倦组)单号日期采用特制束缚筒,每次3h,双号日期令大鼠在冷水(10±1)℃中游泳7min,连续2周。劳倦组、空白组常规标准大鼠颗粒饲料喂养12周,高脂组大鼠以高脂饲料喂养12周,均自由饮食饮水。采用RT-PCR和Western blot法检测肺、脾、肝、肾、胃、小肠、大肠组织oatp4a1 mRNA、蛋白表达。结果劳倦组大鼠扎堆懒动,烂便,毛色粗糙,饮食饮水量减少,体重下降(P<0.05),与临床脾虚证表现基本相符,提示劳倦伤脾动物模型造模全部成功。高脂组大鼠第9周之后开始出现食欲不振,精神萎靡,嗜卧懒动,毛发疏松粗糙,晦暗无光泽等脾虚症状,形成痰湿证大鼠。与空白组比较,高脂组第9周平均体重升高(P<0.05)。oatp4a1mRNA在肺、脾、肝、肾、胃、小肠、大肠7种脏器中都有表达;各组各组织oatp4a1mRNA表达量比较,差异均无统计学意义(P>0.05);高脂组大鼠肺、肾oatp4a1mRNA表达量均高于肝(P<0.05)。结论 oatp4a1可能是高脂伤脾大鼠机体参与湿浊转运的物质基础之一,其中肺、肾、大肠在湿浊转运中可能起着重要作用。

抗人有机阴离子转运蛋白3抗体制备及其在肾脏定位的研究

目的采用新的基因免疫方法制备小鼠抗人有机阴离子转运蛋白3(anti-humanorganicaniontransporter3,hOAT3)多克隆抗体,并用该抗体对hOAT3在人肾小管上皮细胞的表达进行定位研究。方法应用Accelrys软件分析hOAT3抗原表位,选择其细胞内表位,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法从人肾组织RNA中扩增其261bp的cDNA序列,克隆到pBQAP-TT构建基因免疫载体,与辅助载体pCMVi-GMCSF和pCMVi-FlT3L同时免疫小鼠,5周后获得血清抗体,人肾组织Westernblot和免疫组化鉴定抗体的特异性和定位表达。结果成功构建基因免疫载体pBQAP-TT-hOAT3,序列分析鉴定正确,ELISA方法测得抗体滴度高达1∶3000,该抗体识别人肾皮质膜蛋白62×103的hOAT3,人肾组织免疫组化提示该抗体识别定位在肾小管上皮细胞基底膜。结论成功用基因免疫方法制备高效特异性抗hOAT3多克隆抗体,为今后的生理病理研究奠定基础。

有机阴离子转运蛋白的研究进展

有机阴离子转运蛋白(organic anion transporters,OATs)是一类底物特异性较差、主要表达于屏障上皮的转运蛋白,主要位于肾近曲小管,在其他器官如肝、脑和胎盘也有分布,介导众多带负电的体内代谢产物(包括尿酸、神经递质酸性代谢终产物、甾体激素、前列腺素等)和药物跨细胞转运,对药物排泄和药动学有重要影响。本文就已克隆的各亚型OATs的特性、生理功能及其活性调节、转运机制、底物、对药动力学的影响等方面作一介绍。

北京地区汉族人群溶质载体有机阴离子转运蛋白家族1B1与载脂蛋白E基因多态性分布及其意义

目的探讨北京地区汉族人群溶质载体有机阴离子转运蛋白家族1B1(SLCO1B1)与载脂蛋白E(ApoE)基因多态性分布及其临床意义。方法连续入选2019年7月至2020年1月首都医科大学附属北京安贞医院住院和门诊患者以及健康检查志愿者8132例,采用聚合酶链反应荧光探针法检测SLCO1B1(rs2306283:388 A>G,rs4149056:521 T>C)及ApoE(rs429358:388 T>C,rs7412:526 C>T)多态性位点,分析基因多态性分布情况,分别比较不同性别和不同年龄分层人群SLCO1B1与ApoE基因多态性分布、基因型分布及多态性位点突变频率的差异。结果北京地区汉族人群中共检出SLCO1B1基因8种表型,*5/*5未检测到,*1a/*1a、*1a/*1b、*1b/*1b、*1a/*5、*1a/*15、*1b/*15、*5/*15和*15/*15检出者分别为567例(6.97%)、2619例(32.21%)、3241例(39.85%)、3例(0.04%)、473例(5.82%)、1128例(13.87%)、2例(0.02%)和99例(1.22%)。根据服用他汀类药物后发生横纹肌溶解症或肌病的风险及服用药物的剂量分为正常代谢型、中间代谢型和弱代谢型,占比分别为79.03%(6427/8132)、19.72%(1604/8132)和1.24%(101/8132)。北京地区汉族人群中共检出ApoE基因6种不同表型,ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4和ε4/ε4检出者分别为45例(0.55%)、956例(11.76%)、107例(1.32%)、5616例(69.06%)、1331例(16.37%)、77例(0.95%)。根据不同基因型发生冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑梗死、阿尔茨海默病等的风险及服用他汀类药物的疗效将其分为三大类,ApoE保护类基因型、ApoE大众类基因型和ApoE风险类基因型,占比分别为12.31%(1001/8132)、70.38%(5723/8132)和17.31%(1408/8132)。同时具有ApoE保护类基因型和SLCO1B1正常代谢型患者796例(9.79%),同时具有ApoE风险类基因型和SLCO1B1弱代谢型患者23例(0.28%)。在男性和女性人群以及年龄≤60岁和>60岁人群中,SLCO1B1均以正常代谢型占比最高,ApoE均以大众类基因型占比最高,不同性别和不同年龄分层人群SLCO1B1和ApoE基因型分布情况差异均无统计学意义(均P>0.05)。SLCO1B1及ApoE基因的上述多态性位点突变频率观察值符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P>0.05),具有群体代表性。结论本研究具有群体代表性,北京地区汉族人群SLCO1B1和ApoE基因多态性与性别和年龄分层无关,根据基因型及时调整他汀类药物用药方案,有助于实现个体化用药和安全用药。

有机阴离子转运蛋白介导马兜铃酸进入肾小管上皮细胞

目的探讨马兜铃酸是否能进入人近端肾小管上皮细胞(HKC)及其进入HKC的可能途径。方法液相色谱-串联质谱法检测经马兜铃酸钠作用后HKC破碎液中马兜铃酸的含量。乳酸脱氢酶释放实验检测马兜铃酸钠对HKC的毒性作用,并比较有机阴离子转运蛋白抑制剂丙磺舒与有机阳离子转运蛋白抑制剂四乙基铵对马兜铃酸钠导致的细胞毒作用的影响。逆转录实时聚合酶链反应和免疫印迹法检测马兜铃酸钠对HKC表达结缔组织生长因子的影响。结果马兜铃酸钠孵育后的细胞破碎液中可检测到马兜铃酸。60mg/L马兜铃酸钠可使HKC的乳酸脱氢酶释放率显著升高(P<0.01),丙磺舒可显著抑制上调的乳酸脱氢酶释放(P<0.05),而四乙基铵却无此作用。丙磺舒可抑制马兜铃酸钠诱导的结缔组织生长因子高表达(P<0.05)。结论马兜铃酸钠能通过HKC的细胞膜有机阴离子转运蛋白进入细胞发挥生物学效应和毒性作用。

有机阴离子转运蛋白介导绿原酸肾小管分泌

利用狗肾近端小管上皮(MDCK)细胞单层模型比较丙磺舒、牛磺酸、青霉素钠等不同药物转运蛋白底物对双黄连口服液中绿原酸分泌的影响.MDCK细胞以1.5×104个细胞/孔接种于Milli-cell-CMculture plate inserts上培养,定期观察细胞形态,测定跨膜电阻值,待细胞单层达到一定致密程度后进行分泌实验.用M2e酶标仪测定单用双黄连口服液和合用丙磺舒、牛磺酸、青霉素钠时各组双黄连口服液中绿原酸的跨细胞转运情况,计算累积分泌量.实验结果表明,合用不同转运蛋白底物后,双黄连口服液中绿原酸的分泌量均明显降低.可见绿原酸经肾小管上皮细胞的分泌过程是一可饱和过程,有机阴离子转运蛋白部分参与绿原酸的分泌机制.

有机阴离子转运蛋白3在人血管平滑肌细胞的表达

目的检测有机阴离子转运蛋白3(OAT3)及其mRNA在人血管平滑肌细胞的表达,并观察尿酸刺激对其表达的影响。方法分离培养人脐动脉血管平滑肌细胞,随机分为正常对照组及尿酸处理组,提取细胞总RNA,RT-PCR方法扩增特异性OAT3 cDNA片段,制备探针,用Northern blot方法检测各组OAT3 mRNA的表达。提取细胞膜蛋白,用Westernblot方法检测各组OAT3的蛋白表达。结果在正常对照组人血管平滑肌细胞可检测到OAT3mRNA和蛋白的表达。与对照组相比,尿酸处理组血管平滑肌细胞OAT3的表达在mRNA及蛋白水平均显著上调(P<0.05,n=3)。结论人血管平滑肌细胞表达OAT3,尿酸处理可以使其表达上调。提示OAT3可能部分介导血管平滑肌细胞对尿酸的摄取过程。

有机阴离子转运蛋白在药物肾脏转运中的作用

近端肾小管上皮细胞有机阴离子转运蛋白家族(OATs)介导多种内源性和外源性有机阴离子包括多种药物的肾脏分泌和重吸收。其中OAT1和OAT3主要表达在近端肾小管上皮细胞基底侧膜,在介导有机阴离子进入肾小管上皮细胞中发挥重要作用。本文综述了OAT1和OAT3对药物肾脏转运以及药物相互作用的影响。

有机阴离子转运蛋白1研究进展

有机阴离子转运蛋白1(hOAT1),主要表达于肾近曲小管上皮细胞基底膜。它可以介导有机阴离子进入其分布的细胞,进而参与肾脏对尿酸盐的分泌和重吸收过程。本文从hOAT1的分子生物学基础、主要功能、底物的特异性及其功能等进行综述。

人源有机阴离子转运多肽1B1和多药耐药相关蛋白2双转MDCKⅡ细胞株的构建及其功能验证

目的构建人源有机阴离子转运多肽1B1(human organic anion transporting polypeptide 1B1,hOATP1B1)和多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein2,hMRP2)双转MDCKⅡ细胞株,验证其功能,并应用其考察创新药物2,3-双加氧化酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)抑制剂1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan,1-MT)的转运特性。方法采用基因工程手段获得hOATP1B1和hMRP2表达真核载体pVITRO2-SLCO1B1-ABCC2,转染MDCKⅡ细胞,通过遗传霉素G418筛选得到稳定表达的细胞株;通过Realtime PCR、Western blot、免疫荧光共聚焦显微镜确认目的蛋白特异性;利用该双转模型考察普伐他汀(不同pH环境和不同底物浓度)和1-MT的转运。结果经电泳分析、双酶切、DNA测序鉴定表明重组质粒构建成功;通过Real-time PCR、Western blot、免疫荧光共聚焦显微镜证明经遗传霉素筛选的MDCK-OATP1B1/MRP2细胞构建成功;pH=6.5时,普伐他汀在所构建双转细胞模型上转运最佳;在0~500μmol/L的浓度范围内,普伐他汀在该模型上的转运呈现浓度依赖性。1-MT在该细胞模型上无明显转运。结论成功构建人源MDCKOATP1B1/MRP2双转细胞株,发现1-MT既不是OATP1B1蛋白也不是MRP2蛋白的底物,该细胞株可用于OATP1B1/MRP2介导的外源性物质(如药物)和内源性物质(如胆红素)的转运研究。

有机阴离子转运蛋白在肾脏尿酸排泄中的作用研究进展

痛风及高尿酸血症是临床常见病、多发病,主要特征为血尿酸水平升高,其发生与尿酸生成增加和/或尿酸排泄不足有关。肾作为尿酸排泄的主要器官,负责机体2/3的尿酸排泄。目前研究认为,肾脏尿酸盐相关转运蛋白介导了尿酸的重吸收和再分泌,在维持人体血尿酸的稳态中发挥着重要作用,其表达异常和功能改变与高尿酸血症的发生和发展密切相关。尿酸转运相关蛋白的研究涉及尿酸盐阴离子转运蛋白1(URAT1)、葡萄糖转运蛋白9、ATP结合盒式蛋白(ABC)家族、钠依赖性磷酸盐转运蛋白1(NPT1)、NPT4和有机阴离子转运蛋白家族的转运蛋白(OAT)等。本文就目前发现的主要有机阴离子转运蛋白家族成员(OAT1、OAT2、OAT3、OAT4、OAT10和URAT1)在肾脏尿酸排泄中的作用进行综述。

有机阴离子转运蛋白研究进展

有机阴离子转运蛋白(OAT)是一类底物特异性差、主要表达于屏障上皮细胞的转运蛋白,属于溶质载体超家族(SLC)。此类蛋白主要位于肾近曲小管,在其他器官如肝、脑和胎盘也有分布,主要负责内源性和外源性有机阴离子的重吸收和分泌,介导众多带负电的体内代谢产物(包括尿酸、前列腺素、神经递质酸性代谢终产物、甾体激素等)和多种药物的跨细胞膜转运,对药物的排泄和药代动力学特性有重要影响。本文就目前发现的OAT家族各亚型成员的研究进展进行综述。

有机阴离子转运蛋白1对大鼠滑膜细胞吸收甲氨蝶呤、增殖及迁移的影响

目的探讨有机阴离子转运蛋白1(OAT1)对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)吸收甲氨蝶呤(MTX)以及对其增殖和迁移的影响。方法对CIA大鼠FLS使用转染技术上调OAT1的表达,并用Western blot、RT-qPCR方法验证转染效率。将FLS分为阴性对照组(NC组)、Overexpress组,并用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(20 ng/ml)刺激。另取正常大鼠FLS为对照组(Control),给予同浓度(100 ng/ml)MTX和OAT1特异性底物对氨基马尿酸(PAH),采用UPLC-MS/MS方法评估FLS对MTX及PAH吸收功能。给予MTX(100 ng/ml)后使用CCK-8、Transwell方法检测FLS增殖效应及迁移能力。结果与NC组相比,Overexpress组的OAT1及Slc22a6表达均上升;与NC组比较,OAT1过表达组FLS对MTX和PAH的吸收在15、30、45、60、120 min时均增加;与NC组比较,Overexpress组FLS的增殖效应在12 h时下降,并趋近于Control组水平;与NC组比较,12 h时OAT1过表达组的迁移能力下降,并趋近于Control组水平。结论OAT1表达的升高能增加炎性FLS对MTX的吸收,并可抑制其异常的增殖效应和迁移能力。

有机阴离子转运体1B1与载脂蛋白E基因多态性分布及对服用瑞舒伐他汀的风险评估

目的:分析有机阴离子转运体1B1(SLCO1B1)与载脂蛋白E(ApoE)基因多态性分布及其对瑞舒伐他汀使用风险的评估价值。方法:选取2017年4月至2020年2月,我院心血管内科收治的高脂血症患者108例,均口服瑞舒伐他汀钙片10 mg/次,1次/d,睡前服用。采用纳米磁珠法提取全血基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)-焦磷酸测序法测定SLCO1B1与ApoE基因多态性,比较不同SL-CO1B1基因型、不同ApoE基因型患者服药前后TC、TG、HDL-C、LDL-C水平和不良反应发生率。结果:SLCO1B1(521T>C)基因型分布为TT 73.15%、TC 23.15%、CC 3.70%;ApoE基因型分布为ε3/ε364.81%、ε2/ε312.96%、ε3/ε417.59%、ε4/ε44.64%,未见ε2/ε2、ε2/ε4基因型;服药6周后,TC型、CC型TC、LDL-C水平低于TT型,TC型、CC型HDL-C高于TT型(P<0.05),三种基因型患者TG比较,差异无统计学意义(P>0.05);ApoE基因型中,ε3/ε3型服药后TC、LDL-C高于其他基因型(P<0.05),四种基因型TG、HDL-C比较,差异无统计学意义(P>0.05);TC型、CC型肌痛发生率高于TT型,ε2/ε3型头痛、恶心、腹痛、瘙痒发生率高于其他基因型(P<0.05)。结论:SLCO1B1、ApoE基因多态性分布与瑞舒伐他汀疗效和安全性有一定关联,检测SLCO1B1与ApoE基因型有助于进行疗效预测和风险评估,实现个体化给药。

有机阴离子转运蛋白T521C基因多态对雌激素受体阳性乳腺癌患者他莫昔芬疗效的影响

目的研究有机阴离子转运蛋白(OATP1B1)T521C基因多态对雌激素受体(ER)阳性乳腺癌患者他莫昔芬疗效的影响。方法入选186例ER阳性乳腺癌患者,收集其临床特征、他莫昔芬使用情况和生存状态等相关资料;采集患者外周静脉血3 ml或石蜡组织切片用于DNA提取;焦磷酸测序技术进行OATP1B1 T521C基因分型;查明OATP1B1 T521C等位基因在死亡组和存活组的分布情况,分析年龄、绝经状态、肿瘤大小、淋巴结转移、孕激素受体(PR)和C-erbB2对ER阳性乳腺癌患者预后的影响。结果 OATP1B1 521 TT、TC、CC 3种基因型在死亡组的分布频率为82.5%、17.5%和0,等位基因T和C的频率为91.3%和8.8%。OATP1B1 521 TT、TC、CC 3种基因型在存活组的分布频率为74.7%、21.9%、3.4%,等位基因T和C的频率为85.6%和14.4%。OATP1B1 T521C等位基因频率在死亡组(8.8%)和存活组(14.4%)频率的差异无统计学意义(P=0.19)。死亡组和存活组的年龄、绝经状态、肿瘤大小和PR差异均无统计学意义(P>0.05),死亡组患者淋巴结转移所占比例高于存活组(36/40 vs.77/146,P<0.001),C-erbB2阳性率高于存活组(27/40 vs.45/140,P<0.001)。结论 OATP1B1 T521C变异对接受他莫昔芬治疗的ER阳性乳腺癌患者预后没有显著影响,而淋巴结转移和C-erbB2表达阳性与乳腺癌患者预后显著相关。

泄化浊瘀方总皂苷对痛风及高尿酸血症HK-2细胞有机阴离子转运蛋白基因表达的影响

泄化浊瘀方临床主要用于痛风及高尿酸血症（痰瘀痹阻证）的治疗，临床疗效确切。前期实验及临床研究表明，其具有抑制黄嘌呤氧化酶的活性，抑制尿酸生成，

有机阴离子转运肽在药物转运中的作用

溶质运载蛋白家族(solute carrier family,SLC)和ATP结合盒转运蛋白家族(ATP binding cas-sette family,ABC)在药物吸收、消除和组织分布中起重要作用。本综述将对有机阴离子转运肽(or-ganic anion transporting polypeptide,OATP)的最新命名、分类、组织分布、功能及在药物转运中的作用加以介绍。