抗人端粒酶蛋白亚基单域抗体制备和鉴定

目的 研制抗人端粒酶逆转录酶 (hTERT)蛋白亚基单域重组抗体。方法 以重组His taghTERT融合蛋白为抗原免疫小鼠 ,以逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增小鼠脾细胞重链可变区 ;经克隆噬菌粒载体pCANTAB 5E及转染大肠杆菌建立噬菌体抗体展示文库 ,经过亲和性富集选择阳性克隆 ,并于大肠杆菌 (E .coli.HB2 15 1)中表达为可溶性单域抗体 ;Westernblot确定单域抗体结合特性。结果 以RT PCR扩增His taghTERT免疫小鼠脾细胞RNA ,得到 35 0bp小鼠重链可变区DNA片段 ;通过克隆及转染制备出噬菌体展示抗体文库 ,文库大小是 8× 10 4 ;经过抗原 抗体亲和性筛选 ,得到 4个克隆 ,并表达为可溶性单域抗体 (相对分子质量 16 0 0 0 ) ;WesternBlot分析显示 :其中 2个克隆的可溶性单域抗体可特异性结合His taghTERT融合蛋白 (相对分子质量 16 70 0 ) ,与His tag无关 ;与人癌细胞表达的天然hTERT蛋白 (相对分子质量 12 70 0 0 )分析亦显示其特异性结合能力。DNA序列分析证实可溶性单域抗体为小鼠抗体重链可变区VH基因编码。结论 利用噬菌体展示技术已初步制备出小鼠重链可变区编码的抗hTERT蛋白的特异单域抗体 ,为进一步探索其抑制端粒酶活性及抗肿瘤作用奠定了基础。

抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因在烟草中的表达

构建了含抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因ScFv-hTERT的植物表达载体p1304-SH,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草.转基因烟草植株叶片总DNA的PCR,Southern b lot检测结果表明,ScFv-hTERT基因已整合进了转基因烟草植株基因组中;RT-PCR,SDS-PAGE分析证实目的基因已在烟草叶片中成功表达,竞争性ELISA的结果表明,表达的重组抗体与其抗原有良好的结合活性.

非小细胞肺癌组织中端粒酶逆转录酶表达的临床研究

目的:探讨端粒酶逆转录酶在肺癌中表达及其临床病理意义。方法:采用兔抗人端粒酶逆转录酶抗体(Telomerasereversetranscriptase,TRT),SP免疫组化方法检测32例经福尔马林固定、石蜡包埋的原发性肺癌及10例正常肺组织和肺癌低转移细胞株95-C、高转移细胞株95-D中端粒酶逆转录酶的表达状况。结果:肺癌组织中端粒酶逆转录酶表达的阳性率为100%(32/32),TRT表达定位于胞浆和(或)细胞核,其中高表达率为65.6%(21/32),低表达率为34.4%(11/32)。10例正常肺组织TRT表达阴性。癌及癌旁呈反应性增生的细支气管粘膜上皮和肺泡上皮细胞以及间质淋巴细胞、浆细胞、组织细胞等均呈中～强度TRT阳性表达。低转移及高转移肺癌细胞株分别呈TRT低和高表达。TRT高表达与肺癌转移明显相关(P<0.01);但与肺癌病理组织学分型、分级均无明显关系(P>0.05)。结论:TRT表达可能与肺癌的侵袭转移活性相关。TRT在癌间质和癌旁呈反应性增生的正常组织及细胞的表达可能与干细胞的增殖分化相关。TRT蛋白的原位检测更为直观,有利于肺癌的临床病理诊断和预后评估。