RACE策略克隆抗人CD16单克隆抗体轻链可变区基因

鼠源性单克隆抗体(mAb)应用于人体治疗首先需对其进行基因工程化改造.目前, 常用的克隆mAb可变区基因的方法, 是利用抗体可变区内骨架区(FR)序列的保守性, 设计一组通用引物, 采用RT-PCR法扩增可变区基因[1,2].但由于引物的简并性, 克隆过程中将不可避免地改变抗体可变区两侧(FR1、FR4)的氨基酸序列, 这些改变可能导致基因工程抗体亲和力降低[3].我们对传统方法进行了改进, 采用5′-RACE(rapid amplification of cDNA end, RACE)克隆的策略, 获得了抗人CD16 mAb轻链可变区(VL)基因的真实序列.

注射抗CD20单克隆抗体后发生荨麻疹性血管炎一例

患者,女,61岁。全身皮肤泛发红斑1天。起病前7天因“红斑型天疱疮”应用抗CD20单克隆抗体治疗。用药后躯干、四肢泛发水肿性红斑。结合组织病理诊断为荨麻疹性血管炎。给予甲泼尼龙、氯雷他定等治疗,4天后患者皮疹逐渐消退,原有红斑部位可见色素沉着斑。随访8个月,皮疹未复发。

抗独特型抗体在CD47单抗治疗患者抗体筛查和配血中的应用

目的 对接受CD47单克隆抗体治疗的受试组患者使用CD47抗独特型抗体(CD47 anti-idiotypic antibody, CD47 AID)中和法(方法1)与缺乏抗IgG4抗人球蛋白法(方法2)进行输血前抗体筛查和主侧配血,比较经此两种方法配血后的输注效果,以评估CD47 AID中和法的可行性。方法 对本院接受CD47单克隆抗体治疗的18位临床受试者用药物后标本,使用方法1与方法2进行抗体筛查和主侧配血,比较输血后血红蛋白差值ΔHb(输血后Hb-输血前Hb)是否有差异;比较使用方法1进行配血的受试组患者与对照组患者(使用普通微柱凝胶法配血且未使用CD47单抗)输血后ΔHb是否有差异。结果 使用方法1与使用方法2进行配血的患者输血后ΔHb比较,两者之间无统计学差异(8.40±0.71 vs 7.36±0.94,P>0.05);使用方法1进行配血的受试组患者与未使用CD47单抗的对照组患者输血后ΔHb比较,两者之间无统计学差异(8.40±0.71 vs 6.59±0.77,P>0.05)。结论 受试组患者采用方法1配血具有与方法2配血相同的输注效果,且具有操作简单、结果客观准确的特点,推荐使用方法1对使用CD47单抗的患者进行输血前抗体筛查及主侧配血。

抗人CD38单克隆抗体的制备、鉴定及其功能的初步研究

目的 研制抗人CD38抗原分子的单克隆抗体 ,进一步研究其生物学功能。方法 采用高表达CD38抗原的Daudi细胞免疫Balb c小鼠 ;取其脾细胞与SP2 0细胞融合 ;用间接免疫荧光法进行杂交瘤筛选 ;流式细胞术、免疫沉淀法与CD38分子原核表达产物的Western blot分析鉴定单克隆抗体的特异性。以MTT(四甲基偶氮唑盐 )法检测单克隆抗体抑制细胞增殖以及介导补体杀伤靶细胞的功能。结果 获得了一株抗人CD38分子的单克隆抗体 1C6 ,流式细胞术显示它具有CD38抗原特异的细胞反应谱 ,其识别的抗原分子质量为 4 5 0 0 0u。与CD38分子原核表达产物的Western blot分析表明 ,其可特异识别CD38分子胞外结构域。MTT法显示其可介导补体杀伤靶细胞。结论 成功制备了抗人CD38分子的单克隆抗体 ,并进行了初步的功能研究。

抗人CD154单克隆抗体抑制免疫应答的实验研究

目的 :探讨抗人CD1 54单克隆抗体对免疫应答的抑制作用。方法 :①在体外进行混合淋巴细胞反应 ,研究抗人CD1 54单克隆抗体对淋巴细胞增殖反应的影响 ;②在严重免疫联合缺陷 (SCID)鼠体内重建人的免疫功能后 ,研究抗人CD1 54单克隆抗体在SCID小鼠体内对T细胞增殖的影响和对B细胞功能的影响。结果 :①双向混合淋巴细胞反应结果显示 ,抗体的 5个剂量组的 [3H] -TdR的掺入率均显著低于对照组 (均P <0 .0 1 ) ;②在输注人外周血单个核细胞第 6d、第 1 2d、第 2 1d ,实验组SCID鼠体内人T细胞占SCID鼠淋巴细胞的百分率均明显低于对照组(均P <0 .0 5) ;在输注人外周血单个核细胞后的第 1 2d、第 2 1d、第 31d ,实验组SCID鼠体内人IgG的含量明显低于对照组 (均P <0 .0 5)。结论 :抗人CD1 54单克隆抗体能够在体外抑制淋巴细胞的增殖 。

抗CD20单克隆抗体治疗难治性自身免疫性溶血性贫血

本研究初步观察抗CD20单克隆抗体利妥昔(rituximab)用于治疗难治性自身免疫性溶血性贫血(AIHA)的疗效和安全性。对1例用糖皮质激素、脾切除治疗无效的AIHA患者,采用利妥昔单克隆抗体,375mg/m2,每周1次,共4次,观察溶血症状的改变并监测血红蛋白(Hb)水平及其它检验指标,同时观察有无不良反应发生。结果表明,首次治疗后11天乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(IBIL)逐渐下降,第45天降至正常范围;首剂治疗25天后Hb水平比治疗之前升高到95-100g/L以上。治疗后已4月余,患者仍处于缓解状态。治疗过程中未发生明显不良反应。结论:抗CD20单克隆抗体利妥昔用于治疗难治性自身免疫性溶血性贫血是有效而且安全的。

抗CD25单克隆抗体治疗耐激素的急性移植物抗宿主病疗效分析

本研究探讨抗CD25单克隆抗体在单倍体相合骨髓移植术(hiBMT)后耐激素的急性移植物抗宿主病(aGVHD)治疗中的作用。对15例单倍体相合BMT后出现耐激素的Ⅱ-Ⅳ度aGVHD的患者给予巴利昔单克隆抗体20 mg,第1、4天静脉点滴,未达到疗效的病人间隔1周后重复本治疗。结果显示:完全有效8例(53.33%),其中4例无病生存,2例生存伴局限性cGVHD,2例死于肺部感染;3例部分有效(20%),其中1例无病生存,1例死于aGVHD及感染,1例死于肺部感染;4例无效(26.67%)死亡,死亡原因有GVHD、肺部感染、心力衰竭。总有效率73.33%,总生存率46.67%。该药应用安全,未发现输注相关的毒副作用。结论:抗CD25单克隆抗体对单倍体相合BMT后耐激素的Ⅱ-Ⅳ度aGVHD具有较好的疗效,但总的生存率仍然较低,感染仍然是导致该类患者死亡的主要原因,因此加强环境保护,预防感染极为重要。

抗CD20单克隆抗体在儿童原发性难治性肾病综合征的应用新进展

原发性难治性肾病综合征(idiopathic refractory nephritic syndrome,IRNS)一直是临床治疗的棘手问题。抗CD20单克隆抗体是一种诱导B细胞溶解和凋亡的新型免疫抑制剂,其出现极大地改善了IRNS患者的预后。近年来,多数病例分析和临床试验对抗CD20单克隆抗体治疗儿童IRNS的有效性进行了报道。本文就抗CD20单克隆抗体的作用机制、在IRNS的临床应用、不良反应及研究中存在的问题进行综述。

抗CD25单克隆抗体对CD^4+CD25^(high)调节性T细胞的影响

目的评价抗CD25单克隆抗体对活体肾移植受者外周血CD4+CD25high调节性T细胞(Treg)的影响。方法观察14例活体肾移植受者外周血CD4+CD25highT细胞百分比和FoxP3mRNA表达水平的变化,应用流式细胞仪FACSCalibur和CellQuest软件行双色流式细胞计数和结果分析,半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对肾移植受者外周血单个核细胞(MNC)的FoxP3基因水平进行检测。结果在移植术后3d、13d,CD4+CD25highT细胞占CD4+比例显著升高;在移植后1个月内,CD4+CD25highT细胞比例升高约至原来的3倍。移植术后13d、17d、27d时外周血FoxP3mRNA表达明显高于移植术后3d。在肾移植术后的不同时间抗CD25单克隆抗体使用组受者的CD25+T细胞百分比明显低于对照组(未使用抗CD25单克隆抗体)。抗CD25单克隆抗体使用组与对照组两组间比较,术后3d、13d,抗CD25单克隆抗体组CD4+CD25highT细胞占CD4+的比例明显降低,术后3d对照组、抗CD25单克隆抗体使用组分别为1.24%±0.15%、2.25%±0.24%,P=0.00;术后13d为3.75%±0.38%、7.28%±0.51%,P=0.00。然而,术后17d、27d后,抗CD25单克隆抗体使用组的CD4+CD25highT恢复到对照组水平,两组间CD4+CD25highT细胞占CD4+的比例无统计学差异,即第17d为3.72%、0.26%、4.43%、0.44%,P=0.17,27d为9.00%±0.30%、8.31%±0.33%,P=0.16。在肾移植术后不同时间,受者外周血FoxP3mRNA表达水平在两组之间相似,无统计学差异,说明FoxP3mRNA表达水平并没有受到体内注射抗CD25单克隆抗体影响。结论抗CD25单克隆抗体的使用对活体肾移植受者外周血CD4+CD25high调节性T细胞在一定时间具有暂时性的影响,而FoxP3mRNA表达水平没有受到影响。

氟哒拉滨联合抗CD单克隆抗体和氨磷汀治疗高龄慢性淋巴细胞白血病

慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种恶性淋巴细胞增生性疾病,老年人多发。目前CLL治疗的主要问题是:①治疗完全缓解率低;②CLL伴随免疫系统功能紊乱和治疗药物的骨髓抑制、感染等副作用,高龄患者难以耐受。本研究报告我科成功治疗1例74岁高龄B细胞性慢性淋巴细胞白血病患者。在治疗中采用核苷酸还原酶抑制剂即氟达拉滨,联合抗CD20单克隆抗体方案,按标准治疗剂量给药,并根据患者个体情况调整给药时间,运用泛细胞保护剂氨磷汀进行辅助治疗。结果表明:1个疗程治疗后患者达到完全缓解,外周血的细胞计数和分类恢复正常;继续应用氨磷汀辅助治疗20天,患者贫血得到纠正,血红蛋白量稳定在120g/L以上,化疗药物的副作用和并发症均得到了有效的控制。结论:老年CLL患者化疗过程中,采用氟哒拉滨联合抗CD20单克隆抗体方案,按标准剂量给药,同时根据患者自身情况调整给药次序和给药时间,体现个性化治疗,获得满意疗效;氨磷汀可以有效减轻或克服CLL伴随的免疫系统功能紊乱,以及氟哒拉滨、抗CD20单克隆抗体引起的骨髓抑制、感染、发热等副反应。

国产重组抗CD25人源化单克隆抗体在肾移植免疫诱导中的应用研究

目的研究国产重组抗CD25人源化单克隆抗体(健尼哌)在肾移植免疫诱导应用中的有效性和安全性。方法本前瞻性研究对象选取2011年5月至2012年5月在中山大学附属第一医院器官移植中心接受初次亲属活体供肾肾移植患者共20例,随机分为实验组和对照组。实验组10例,免疫诱导给予2剂健尼哌(每剂75 mg,术中1剂、术后14 d 1剂);对照组10例,免疫诱导给予2剂巴利昔单抗(每剂20 mg,术中1剂、术后4 d 1剂)。密切随访,观察两组患者术后急性排斥反应、移植物功能延迟恢复(DGF)、感染等并发症的发生率,记录患者和移植肾的存活情况。分别于术前、术后1 d、术后3 d、术后7 d、术后14 d、术后1个月、术后3个月以及术后6个月,检测两组患者的血清肌酐、血尿素氮、外周血白细胞计数、淋巴细胞比例等实验室检测指标,比较两组间差别。分别于上述各时间点抽取患者外周静脉血2 ml,采用流式细胞仪分析两组患者调节性T细胞比例(Treg%)的变化。结果随访期间,两组患者均无死亡病例。实验组和对照组各有1例患者出现急性排斥反应,经甲泼尼龙冲击治疗及抗胸腺细胞球蛋白(ATG)治疗后,肾功能均恢复至正常。两组患者的急性排斥反应、上呼吸道感染、肺部感染、尿路感染、白细胞减少、血小板减少及DGF等并发症发生率比较,差异无统计学意义(均为P>0.05)。在各时间点上,两组患者的血清肌酐、血尿素氮、外周血白细胞计数、淋巴细胞比例比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。两组患者Treg%的变化基本相似,均在术后1个月内维持较低水平,术后3个月逐渐回升,至术后6个月接近或回复到术前水平。在术前、术后3 d的时间点,两组患者的Treg%差异无统计学意义(均为P>0.05);而在术后1 d、7 d、14 d及1个月的时间点,实验组的Treg%均高于对照组,差异有统计学意义(均为P<0.05);在术后3个月、6个月的时间点,实验组的Treg%均低于对照组,差异亦有统计学意义(均为P<0.05)。结论在肾移植免疫诱导应用中,健尼哌具有和国外同类产品相似的有效性及安全性。

抗CD20单克隆抗体联合CHOP化疗方案治疗人B细胞淋巴瘤的实验观察

目的:以人B细胞淋巴瘤裸鼠皮下移植模型为基础,研究抗CD20单克隆抗体体内、体外活性,评价该抗体联合CHOP化疗方案治疗人B细胞淋巴瘤的有效性。方法:体内实验:建立人B细胞淋巴瘤裸鼠皮下移植模型。52只荷瘤鼠随机分为5组进行实验。用TUNEL法检测肿瘤凋亡,并绘制肿瘤体积曲线和裸鼠体质量曲线。体外实验:用CellTiter96 AQueous非同位素细胞增殖试验试剂盒检测抗CD20单克隆抗体、化疗和联合化疗对Raji细胞体外杀伤作用,并绘制剂量反应曲线。结果:体内实验:鼠抗人CD20单抗组及嵌合CD20抗体组均出现大量肿瘤细胞凋亡。联合治疗组疗效最佳,与其他组相比差异有统计学意义,P<0.05。化疗组及联合治疗组体质量下降明显,与其他组相比差异有统计学意义,P<0.05。体外实验:发现鼠抗人CD20单克隆抗体及嵌合型CD20抗体均可增加Raji细胞对化疗药物的细胞毒敏感性。结论:CD20单克隆抗体对B细胞淋巴瘤具有明显的抑制作用,可以诱发大面积肿瘤细胞凋亡,能提高肿瘤对化疗药物的细胞毒敏感性,且较常规化疗毒副反应小。

抗CD4单克隆抗体可变区基因克隆及序列分析

抗ＣＤ４单抗可延长灵长类动物模型同种器官移植物的存活时间和改善实验性自身免疫疾病的病情［１］。在人类，抗ＣＤ４单抗已被成功地用来治疗类风湿性关节炎［２］、系统性红斑狼疮［３］等自身免疫性疾病和肾移植患者的急性和慢性排斥反应［４］。本文对抗ＣＤ４单克隆...

抗CD44单克隆抗体A3D8对人白血病细胞系HL-60细胞增殖及分化的影响

目的 探讨抗CD4 4单克隆抗体A3D8对HL 6 0细胞增殖及分化的影响 ,寻找急性髓系白血病(AML)治疗的新靶点。方法 以AML细胞株HL 6 0为模型 ,通过观察细胞生长、形态学、表面分化抗原、细胞周期和细胞因子表达 ,以及应用硝基四氮唑蓝 (NBT)还原实验来研究抗CD4 4单克隆抗体A3D8对细胞增殖及分化的影响。结果 HL 6 0细胞高表达CD4 4 ;A3D8以浓度和时间依赖性方式抑制HL 6 0细胞生长。A3D8使HL 6 0细胞周期阻滞在G0 /G1期 ,CD11b、CD14表面抗原阳性率明显增高 ,细胞体积增大 ,核 /浆比例减小 ,核染色质聚集 ,NBT还原实验阴性 ,细胞表达粒细胞集落刺激因子mRNA ,呈现向单核细胞系方向分化。结论 A3D8可抑制HL 6 0细胞增殖 ,并诱导其向单核系细胞分化 ,CD4 4有可能成为AML治疗的新途径。

^(131)I标记抗CD20单克隆抗体在荷瘤裸鼠体内的放射免疫显像

目的探讨131I-anti-CD20McAb经瘤内注射后在荷人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji细胞移植瘤裸鼠体内的放射免疫显像。方法131I标记物的标记采用IODO-GEN碘化标记;注射标记物后第1、3、7、15天将荷瘤裸鼠SPECT显像后活杀,定标器测量并计算瘤、血等12种器官或组织的%ID/g值,根据MIRD委员会推荐的公式计算肿瘤累积吸收剂量。结果131I-anti-CD20McAb瘤内注射组的SPECT显像结果优于腹腔注射组和131I-IgG瘤内注射组,该组肿瘤%ID/g值在给药后第1、3和7天分别为后两组的1.4～17倍和1.7～3.7倍,肿瘤累及吸收剂量在给药后第3、7和15天分别为后两组的1.5～2.5倍和6.0～12.6倍。结论131I-anti-CD20McAb经瘤内途径给药可以使肿瘤获得最高的放射性药物摄取率,为下一步运用该途径进行放射免疫治疗提供了实验依据。

抗角蛋白16单克隆抗体对角质形成细胞增殖活性的影响

目的研究抗角蛋白单克隆抗体(mAb)对体外培养的角质形成细胞增殖活性与细胞周期的影响。方法以无血清培养基体外原代培养角质形成细胞。应用3H-TdR掺入DNA合成测定法,观察抗角蛋白16mAb(anti-K16mAb)对角质形成细胞代谢增殖的影响。用流式细胞仪分析anti-K16mAb作用后角质形成细胞的细胞周期变化。结果mAb作用后,角质形成细胞样品的cpm降低,并呈抗体剂量依赖方式。流式细胞仪分析表明,处于S期的细胞比例由27%上升至42.2%,同时处于G1期与G2期的细胞比例分别相应下降。结论anti-K16mAb可抑制体外培养的角质形成细胞的增殖活性,且将细胞阻滞于S期,无法进入G2期与M期分裂增殖。

重组抗CD25人源化单克隆抗体治疗激素耐药急性移植物抗宿主病的临床研究

本研究探讨重组抗CD25人源化单克隆抗体在异基因造血干细胞移植后激素耐药的急性移植物抗宿主病(aGVHD)防治中的作用。对21例异基因造血干细胞移植后出现耐激素的Ⅱ-Ⅳ度aGVHD的患者于第1、4、8 d给予重组抗CD25人源化单克隆抗体1 mg/(kg·d)静脉输注,未达到疗效的病人间隔1周后重复本治疗。结果表明,所有患者中完全有效13例(61.9%),其中4例无病生存,8例生存伴轻度慢性移植物抗宿主病(cGVHD),1例死于白血病髓外复发;6例部分有效(28.57%),其中3例生存伴轻度cGVHD,3例死于肺部感染;2例无效(9.52%)死亡;总有效率90.5%,总生存率71.48%,尤其在单倍体造血衰竭性疾病的6例患者中,有效率高达100%。该药应用安全,未发现输注相关的毒副作用。结论:重组抗CD25人源化单克隆抗体对异基因造血干细胞移植后激素耐药的Ⅱ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病(aGVHD)有较好的疗效,且应用安全。

抗CD25单克隆抗体预防肾移植术后急性排异反应的研究

目的 :研究抗CD2 5单克隆抗体预防肾移植术后急性排异反应的作用。方法 :71例肾移植患者随机分为抗CD2 5单克隆抗体治疗组 2 6例与对照组 4 5例 ,治疗组于肾移植手术前后应用抗CD2 5单克隆抗体 2次 ,对术后急性排异反应发生率、移植肾功能及外周血T细胞亚群进行动态监测。结果 :术后 1、3、6、12个月时急性排异反应的发生率治疗组为 7.7%、19 .2 %、2 3.1%、30 .8% ,对照组为 15 .6 %、2 8.9%、35 .6 %、4 6 .7% ,两组比较有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;术后 1、6及 12个月时治疗组移植肾功能优于对照组 (P <0 .0 5 ) ;术后两组CD3+ 与CD4 + 的表达均下降 ,但两组间无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 :抗CD2 5单克隆抗体可以明显降低肾移植术后急性排异反应的发生率 ,而对T细胞亚群无明显影响。

抗胸腺细胞球蛋白与抗CD3单克隆抗体治疗皮质激素耐药的急性移植物抗宿主病的疗效比较

目的 比较抗胸腺细胞球蛋白 (ATG)和抗CD3单克隆抗体联合大剂量甲基强的松龙 (MP)治疗皮质激素耐药急性移植物抗宿主病 (aGVHD)的疗效。方法 11例异基因外周血干细胞移植的病患者 ,移植后发生Ⅲ～Ⅳ度aGVHD ,经大剂量MP治疗 3～ 9d无效后接受ATG(ATG组 )或抗CD3单克隆抗体 (WuT3组 )联合大剂量MP治疗。ATG 2 .5mg/ (kg·d) ,连续 5～ 7d ;WuT35mg/ (kg·d) ,10～ 14d后停药 ;MP 5mg/ (kg·d) ,aGVHD控制后逐渐减量。 结果 ATG组 :7例中 4例获完全缓解 (CR)、2例部分缓解 (PR)、1例无效 (NR) ,总有效率 85 .7%。WuT3组 :1例获CR、1例PR、2例NR ,1例获CR患者至今已存活 8个月 ,缓解后出现CMV阳性。 4例中有 3例治疗中合并感染。结论 ATG联合大剂量MP治疗皮质激素耐药aGVHD优于抗CD3单克隆抗体。早期ATG联合大剂量MP治疗激素耐药的aGVHD具有较高的疗效。

抗CD44单克隆抗体IM7在体外诱导慢性髓系白血病干／祖细胞的凋亡

本研究探讨抗CD44单克隆抗体IM7在体外诱导慢性髓系白血病干/祖细胞(leukemic stem/progenitor cells,LSPC)凋亡情况及其可能的作用机制。取20例初诊的慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)病人骨髓液5-10ml,用免疫磁株分离法分离出CD34+、CD38-、CD123+LSPC。利用Annexin-V试剂盒检测IM7诱导CML-LSPC凋亡情况;荧光实时定量PCR及RT-PCR检测CML-LSPC中原癌基因c-myc、NF-κB表达水平;Western-blot检测IM7孵育后CML-LSPC中BCL-2蛋白表达变化。结果表明:经IM7孵育后CML-LSPC的早期凋亡率由对照组(5.42±1.84)(升高至(12.58±2.84)((p<0.05)。IM7孵育后CML-LSPC中原癌基因c-myc、NF-κB mRNA表达水平明显降低,IM7能有效抑制CML-LSPC中BCL-2蛋白表达下调,CML-LSPC中NF-κB的活性受到抑制。结论:抗CD44单克隆抗体IM7能有效诱导CML-LSPC凋亡,其可能机制为NF-κB的活性降低,作为下游靶基因c-myc及bcl-2表达下调,从而诱导LSPC凋亡。