抗人CD38分子单克隆抗体生物学功能研究

目的研究抗人CD38单克隆抗体(1C6)的生物学功能。观察1C6对多种肿瘤细胞系生长增殖的影响,利用不同刺激原诱导的淋巴细胞增殖反应,观察抗人CD38单克隆抗体(1C6)在人外周血淋巴细胞增殖反应中的作用。方法以MTT法检测单克隆抗体抑制细胞增殖以及介导补体杀伤靶细胞的功能。利用抗人CD3单克隆抗体刺激人外周血淋巴细胞增殖、同种异型抗原诱导混合淋巴细胞反应,在加入或未加入抗人CD38单克隆抗体(1C6)的情况下,观察细胞形态并检测3H-TdR掺入量。结果加入不同浓度的1C6的实验组与对照组相比,多种细胞系的生长受到不同程度的抑制。不同刺激原诱导的淋巴细胞增殖反应中,加入1C6的实验组细胞克隆明显减少,3H-TdR掺入量明显下降,细胞增殖受抑。结论1C6可抑制多种肿瘤细胞的生长,可介导补体杀伤多种靶细胞。1C6对抗CD3刺激的外周血淋巴细胞增殖以及混合淋巴细胞培养均具有明显的抑制效应。

抗人卵巢癌×抗人CD3双特异性单链抗体的构建、表达及复性研究

构建了抗人卵巢癌×抗人CD3双特异性单链抗体 (scBsAb) ,在大肠杆菌中得到表达。用稀释复性 ,缓慢透析复性和凝胶过滤层析复性三种方法对scBsAb表达形成的包涵体进行复性研究表明 ,凝胶过滤层析复性能有效抑制蛋白的聚集。ELISA检测显示 ,复性后的scBsAb具有较高活性 ,能与相应抗原特异结合。

抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体介导的αβT细胞CDR3谱系漂移

目的探讨抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体(BHL-1)介导的αβT细胞CDR3谱系漂移,为双特异性抗体介导的T细胞免疫应答机制提供理论基础。方法采用免疫扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员T细胞在人卵巢癌SKOV3细胞联合BHL-1刺激前后的TCR库多样性变化(CDR3谱型分布特征)及刺激后T细胞TCRα、β链CDR3优势利用情况,对克隆性增生T细胞的CDR3区进行序列分析。结果刺激前6例正常献血员TCR CDR3谱型均呈高斯分布,刺激后发生CDR3谱系漂移,部分TCR Vα、Vβ家族出现优势增生,明确了BHL-1介导下单克隆增生T细胞的α、β链CDR3序列。结论 SKOV3联合BHL-1诱导的T细胞CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达可能与BHL-1介导的特异性T细胞免疫反应有关,特异应答T细胞TCR CDR3序列的确定,将为卵巢癌的T细胞免疫治疗提供基础。

细胞融合法制备抗人CD3-抗人IgMμ链双特异性抗体

目的制备抗人CD3-抗人IgMμ链双特异性抗体(Bispecificantibody,BsAb)的细胞株,并对建株的杂交-杂交瘤的稳定性及活性进行鉴定。方法将抗人CD3单克隆抗体细胞株采用8-AG诱变成HAT敏感杂交瘤细胞株,再通过FuGENETM6转染含neo基因质粒pCDaA3,制备成具有双标记杂交瘤αCD3HATS G418R亚系,与抗人IgMμ链单克隆抗体细胞株融合,通过ELISA法及流式细胞仪筛选,制备分泌BsAb的细胞株。结果融合6次,共接种1080孔,共得5株抗CD3-抗IgM杂交-杂交瘤。经亚克隆后,其中2株体外连续传代培养2月仍保持良好的分泌BsAb功能。结论采取细胞融合法可成功制备分泌BsAb的杂交-杂交瘤,其稳定性及效价与亲本杂交瘤相似。

抗人CD3人/鼠嵌合抗体基因的构建

为了降低鼠源抗人CD3单抗的免疫原性,增加其在人体内的生物活性及治疗作用,使该抗体能更广泛更有效地长期多次用于人体治疗肿瘤、器官移植排斥反应及自身免疫性疾病.本文采用PCR技术从分泌抗CD3单抗的杂交瘤细胞HIT3a的mRNA中分离克隆了抗体的轻重链可变区基因的cDNA.以此轻重链可变区cDNA为特异探针从HIT3a基因文库中分离带有调控序列的功能性轻重链可变区基因;并将其插入到含有人κ轻链及人γ1重链恒定区基因的哺乳动物表达载体中成功地构建了抗人CD3人/鼠轻重链嵌合抗体基因,为研制人抗CD3人/鼠嵌合抗体完成了关键性的第一步.

抗人CD3人/鼠嵌合抗体的表达及特性

将从HIT3a基因库分离克隆的功能性抗CD3轻重链可变区基因插入含有人κ轻链γ1重链恒定区基因的哺乳动物表达载体中,构建了抗CD3嵌合抗体基因.用Lipofectin将抗CD3人/鼠嵌合轻重链基因共转染SP2/O细胞表达,获得稳定传代和稳定表达抗CD3嵌合抗体的转染杂交瘤细胞株C-HIT3a.ELISA、免疫荧光和PCR实验证实嵌合抗体与原鼠CD3单抗有相同的特异性和亲和性.体外生物活性的初步分析表明嵌合抗体与鼠CD3单抗对人的PBMC细胞的增殖有相同类型的作用.高剂量抗体抑制人T细胞的增殖,低剂量显示明显的激活增殖作用.当与IL-2联合应用其激活增殖作用增加20倍.细胞毒实验表明嵌合CD3抗体或由该抗体介导的免疫活性细胞(CD3-AK)对多种肿瘤细胞有明显的杀伤活性,较单用IL-2或单用LAK细胞其杀伤活性增加25倍.

抗人CD3单链抗体四聚体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定

目的 将抗人CD3单链抗体 (scFv) /人 p5 3四聚功能域融合基因转染到HeLa细胞 ,进行真核表达和活性测定。方法 将抗人CD3scFv /人 p5 3四聚功能域融合基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,转染HeLa细胞进行表达 ,表达产物纯化后利用流式细胞仪进行活性测定。结果 表达产物经SDS PAGE和Westernblot证实 ,为Mr约35 0 0 0的特异蛋白条带。纯化后经流式细胞仪检测 ,可特异性地结合人外周血单个核细胞 (PBMCs) ,亲和力高于scFv。结论 获得了可与PBMCs特异性结合的抗人CD3scFv四聚体 。

抗人卵巢癌-抗人CD3单链双特异性抗体体外介导的细胞毒作用及其机制

目的了解抗人卵巢癌-抗人CD3（BHL—I）单链双特异性抗体（scBsAb）体外介导的外周血淋巴细胞（PBL）对靶细胞SKOV3的细胞毒作用及可能的机制。方法二苯基溴化四氮唑蓝（MTr）法检测BHL-I体外介导PBL对SKOV3细胞的杀伤作用；逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测BHL—I介导的细胞毒作用过程中效应细胞PBL对穿孔素（perforin）、颗粒酶（GrB）mRNA表达的影响；酶联免疫吸附（ELISA）法检测细胞培养上清液中人肿瘤坏死因子-α（hTNF—α）和人干扰素-γ（hIFN-γ）含量的变化。结果BHL-I体外介导PBL对SKOV3细胞的细胞毒作用显著高于对MCF-7细胞的作用（P〈0.01），并且在效靶比为12．5：1、作用时间为36h、BHL-I浓度为25μg/ml时，PBL对靶细胞的细胞毒作用最为显著；BHL—I体外介导的细胞毒作用中，PBL表达perforin、GrBmRNA及混合细胞培养上清液中hTNF—α和hIFN-γ的含量均显著升高，并且白介素2（IL-2）的存在有利于这些因子的表达。结论BHL—I介导PBL对靶细胞的细胞毒作用具有一定的特异性，并且IL-2能增强BHL—I介导PBL的细胞毒作用。

巴利昔单抗联合鼠抗人CD3单克隆抗体在高致敏受者肾移植中的临床应用

目的:探讨巴利昔单抗与鼠抗人CD3单克隆抗体(OKT3)联合诱导在高致敏受者肾移植临床应用中的有效性及安全性。方法:术前2个月内群体反应性抗体(PRA)检测值均>50%的尸体供肾肾移植受者20例,其中9例受者接受巴利昔单抗联合OKT3免疫诱导(联合诱导组),11例受者接受OKT3常规免疫诱导(OKT3诱导组),均以他克莫司(Tac)+吗替麦考酚酯(MMF)+泼尼松(Pred)为基础免疫抑制方案,评估术后移植肾功能恢复情况、3个月内急性排斥反应发生率、1年内肺部感染发生率、1年人/肾存活率及移植肾功能。结果:联合诱导组、OKT3诱导组肾移植术后3个月内急性排斥反应发生率及术后1年内肺部感染发生率分别为11.1%vs.36.4%(P=0.319),11.1%vs.63.6%(P=0.028);联合诱导组患者术后1周内移植肾功能恢复正常比例明显高于OKT3诱导组(88.9%vs.27.3%,P=0.010);联合诱导组术后1年人/肾存活率均为100%,与OKT3诱导组(分别为90.9%、81.8%)比较,差异不显著(P=1.00和P=0.100);术后1年联合诱导组、OKT3诱导组血肌酐值分别为(105±24)、(97±22)μmol·L-1(P=0.437)。结论:巴利昔单抗联合OKT3进行免疫诱导,在预防高致敏受者术后早期排斥反应的同时,缩短了移植肾功能的恢复时间,是一种安全、有效的防治策略。

抗人卵巢癌×抗人CD3×抗CD28V_H单链三特异抗体的胞内可溶表达、纯化及体外活性测定

目的 研究抗人卵巢癌 (ovariancarcinoma ,oc)×抗人CD3×抗CD2 8VH 单链三特异抗体(singlechaintrispecificantibody,scTsAb)在大肠杆菌中的可溶表达与纯化及纯化后产物的活性测定 ,从而为其应用于卵巢癌治疗的临床研究打下基础。方法 将已构建的scTsAb表达载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)Star菌株 ,采用低温 (30℃ )、低剂量IPTG(0 .2mmol L)诱导 ,进行胞内可溶表达。根据抗卵巢癌三特异抗体 (ocTsAb)等电点较高 (pI9.0 ) ,而菌体蛋白大多为酸性蛋白的特点 ,利用DEAE弱阴离子交换层析(pH8.0 )进行一步纯化 ,并利用ELISA及FACS的方法检测纯化后抗卵巢癌三特异抗体的活性。结果 (1)SDS PAGE鉴定低温诱导时可溶比例达到 5 6 %。 (2 )绝大多数菌体蛋白被DEAE层析柱吸附 ,而抗卵巢癌三特异抗体在穿透液中流出 ,SDS PAGE检测纯度达到 90 %。 (3)ELISA结果显示纯化后的抗卵巢癌三特异抗体与重组CD2 8纯抗原 ,Jurkat(CD3+ )细胞膜提取抗原 ,SKOV3细胞膜提取抗原均有特异性结合。 (4 )FACS结果证明纯化后的抗卵巢癌三特异抗体与Jurkat(CD3+ )活细胞、SKOV3活细胞有特异性结合。结论 低温诱导胞内可溶表达的抗人卵巢癌×抗人CD3×抗CD2 8VH 单链三特异抗体经弱阴离子交换层析一步纯化后仍保持原有免疫学活性 。

人源性CD3抗体诱导食蟹猴T淋巴细胞培养方法的建立

目的:在初步分析人、食蟹猴和猪CD3蛋白同源性的基础上,建立利用人源性CD3抗体诱导食蟹猴外周血T淋巴细胞的体外分离培养技术。方法:从NCBI查询获取人类、食蟹猴和猪CD3蛋白各自的氨基酸序列,并用DNAMAN软件进行序列比对、同源性分析和构建系统进化树。Western blotting检测三种T细胞膜上CD3蛋白的表达水平。分离健康食蟹猴PBMC,分为3组,A组加入抗人CD3抗体单刺激、B组加入IL-2单刺激、C组加入抗人CD3抗体和IL-2共刺激。倒置显微镜下观察细胞生长状态并计数,绘制细胞生长曲线,锥虫蓝染色检测细胞活性,流式细胞术检测T细胞表面标志物CD3、CD4、CD8的表达。结果:食蟹猴、猪的CD3蛋白氨基酸序列与人类的同源性分别为86.9%、65.6%,T细胞膜上CD3蛋白的表达量分别为人的79%、17%。A组细胞不增殖;C组细胞增殖能力、细胞活性及CD3表达率[(93.8±3.6)%vs(70.3±4.7)%,P<0.01]均显著高于B组,细胞生长曲线呈S形,符合Logistic生长曲线;C组T细胞高表达CD3,T细胞纯度较高,且CD8+T细胞占比较多。结论:食蟹猴外周血T淋巴细胞膜表面能表达和人同源性很高的CD3蛋白,在人源性CD3抗体、IL-2和1%PHA共刺激下能诱导食蟹猴外周血T淋巴细胞的增殖分化,获得生长状态良好、增殖能力强、纯度较高的T淋巴细胞。

多价抗人精浆蛋白/抗人CD_3双特异性单链抗体的构建及表达

目的 构建多价抗人精浆蛋白 (γ Sm) /抗人CD3 双特异性单链抗体 (scFv)基因 ,并进行真核表达和活性测定。 方法 利用递归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p5 3四聚功能域融合基因 ,克隆入pUC1 9载体中构建pUC1 9/IgG3/p5 3克隆载体。将抗人CD3 scFv(CD3 scFv)和抗人γ SmscFv(γ SmscFv)依次克隆入pUC1 9/IgG3/p5 3载体中 ,构建多价双特异性γ SmscFv/CD3 scFv[scFv2 (CD3 /γ Sm) ]融合基因。将融合基因克隆入真核表达载体pSecTag2 B中 ,转染HeLa细胞进行表达 ,表达产物纯化后流式细胞仪进行活性测定。 结果 获得了多价scFv2 (CD3 /γ Sm)融合基因 ,基因全长 1 6 38bp ,可编码 5 4 6个氨基酸 ,与已发表的γ SmscFv、CD3 scFv和人p5 3四聚功能域基因cDNA序列一致。表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约 6 70 0 0的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞和人外周血单个核细胞 (PBMC) ,亲和力高于双特异性scFv。 结论 获得了可与PBMC和PC 3细胞特异结合的多价scFv2 (CD3 /γ Sm) 。

CAR-T制备工艺中PD-1表达的动力学研究

目的研究嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)制备工艺中抗CD3/CD28磁珠和慢病毒对T细胞中程序性死亡因子1(PD-1)蛋白表达的影响,为改善其体内抗肿瘤活性研究提供理论依据。方法筛选高表达PD-1细胞系,添加CAR-T制备工艺中抗CD3/CD28磁珠和慢病毒(CAR-GFP、CAR-CD19、CAR-CD30),流式细胞术检测T细胞系PD-1蛋白的变化。利用PD-1刺激剂研究CAR-T制备中PD-1的表达。结果流式细胞分析显示,抗CD3/CD28磁珠和CAR-CD30慢病毒能显著刺激Jurkat中PD-1蛋白表达[(63.5±4.9)%和(63.0±5.3)%,P<0.01]。Jurkat添加0.5∶1抗CD3/CD28磁珠刺激后,PD-1表达量在48 h为最大值,之后随时间增加PD-1蛋白表达下降,144 h时下降到(4.5±0.3)%以内。CAR-CD30慢病毒以MOI=3感染复数刺激Jurkat后PD-1蛋白表达比较稳定。T淋巴细胞中添加抗CD3/CD28磁珠能提高约3倍PD-1的表达。结论低浓度抗CD3/CD28磁珠能短暂性刺激T细胞中PD-1蛋白表达且不影响其活率。