细胞融合法制备抗人CD3-抗人IgMμ链双特异性抗体

目的制备抗人CD3-抗人IgMμ链双特异性抗体(Bispecificantibody,BsAb)的细胞株,并对建株的杂交-杂交瘤的稳定性及活性进行鉴定。方法将抗人CD3单克隆抗体细胞株采用8-AG诱变成HAT敏感杂交瘤细胞株,再通过FuGENETM6转染含neo基因质粒pCDaA3,制备成具有双标记杂交瘤αCD3HATS G418R亚系,与抗人IgMμ链单克隆抗体细胞株融合,通过ELISA法及流式细胞仪筛选,制备分泌BsAb的细胞株。结果融合6次,共接种1080孔,共得5株抗CD3-抗IgM杂交-杂交瘤。经亚克隆后,其中2株体外连续传代培养2月仍保持良好的分泌BsAb功能。结论采取细胞融合法可成功制备分泌BsAb的杂交-杂交瘤,其稳定性及效价与亲本杂交瘤相似。

抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体介导的αβT细胞CDR3谱系漂移

目的探讨抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体(BHL-1)介导的αβT细胞CDR3谱系漂移,为双特异性抗体介导的T细胞免疫应答机制提供理论基础。方法采用免疫扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员T细胞在人卵巢癌SKOV3细胞联合BHL-1刺激前后的TCR库多样性变化(CDR3谱型分布特征)及刺激后T细胞TCRα、β链CDR3优势利用情况,对克隆性增生T细胞的CDR3区进行序列分析。结果刺激前6例正常献血员TCR CDR3谱型均呈高斯分布,刺激后发生CDR3谱系漂移,部分TCR Vα、Vβ家族出现优势增生,明确了BHL-1介导下单克隆增生T细胞的α、β链CDR3序列。结论 SKOV3联合BHL-1诱导的T细胞CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达可能与BHL-1介导的特异性T细胞免疫反应有关,特异应答T细胞TCR CDR3序列的确定,将为卵巢癌的T细胞免疫治疗提供基础。

人源性CD3抗体诱导食蟹猴T淋巴细胞培养方法的建立

目的:在初步分析人、食蟹猴和猪CD3蛋白同源性的基础上,建立利用人源性CD3抗体诱导食蟹猴外周血T淋巴细胞的体外分离培养技术。方法:从NCBI查询获取人类、食蟹猴和猪CD3蛋白各自的氨基酸序列,并用DNAMAN软件进行序列比对、同源性分析和构建系统进化树。Western blotting检测三种T细胞膜上CD3蛋白的表达水平。分离健康食蟹猴PBMC,分为3组,A组加入抗人CD3抗体单刺激、B组加入IL-2单刺激、C组加入抗人CD3抗体和IL-2共刺激。倒置显微镜下观察细胞生长状态并计数,绘制细胞生长曲线,锥虫蓝染色检测细胞活性,流式细胞术检测T细胞表面标志物CD3、CD4、CD8的表达。结果:食蟹猴、猪的CD3蛋白氨基酸序列与人类的同源性分别为86.9%、65.6%,T细胞膜上CD3蛋白的表达量分别为人的79%、17%。A组细胞不增殖;C组细胞增殖能力、细胞活性及CD3表达率[(93.8±3.6)%vs(70.3±4.7)%,P<0.01]均显著高于B组,细胞生长曲线呈S形,符合Logistic生长曲线;C组T细胞高表达CD3,T细胞纯度较高,且CD8+T细胞占比较多。结论:食蟹猴外周血T淋巴细胞膜表面能表达和人同源性很高的CD3蛋白,在人源性CD3抗体、IL-2和1%PHA共刺激下能诱导食蟹猴外周血T淋巴细胞的增殖分化,获得生长状态良好、增殖能力强、纯度较高的T淋巴细胞。

抗人CD3单链抗体四聚体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定

目的 将抗人CD3单链抗体 (scFv) /人 p5 3四聚功能域融合基因转染到HeLa细胞 ,进行真核表达和活性测定。方法 将抗人CD3scFv /人 p5 3四聚功能域融合基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,转染HeLa细胞进行表达 ,表达产物纯化后利用流式细胞仪进行活性测定。结果 表达产物经SDS PAGE和Westernblot证实 ,为Mr约35 0 0 0的特异蛋白条带。纯化后经流式细胞仪检测 ,可特异性地结合人外周血单个核细胞 (PBMCs) ,亲和力高于scFv。结论 获得了可与PBMCs特异性结合的抗人CD3scFv四聚体 。

抗人CD38分子单克隆抗体生物学功能研究

目的研究抗人CD38单克隆抗体(1C6)的生物学功能。观察1C6对多种肿瘤细胞系生长增殖的影响,利用不同刺激原诱导的淋巴细胞增殖反应,观察抗人CD38单克隆抗体(1C6)在人外周血淋巴细胞增殖反应中的作用。方法以MTT法检测单克隆抗体抑制细胞增殖以及介导补体杀伤靶细胞的功能。利用抗人CD3单克隆抗体刺激人外周血淋巴细胞增殖、同种异型抗原诱导混合淋巴细胞反应,在加入或未加入抗人CD38单克隆抗体(1C6)的情况下,观察细胞形态并检测3H-TdR掺入量。结果加入不同浓度的1C6的实验组与对照组相比,多种细胞系的生长受到不同程度的抑制。不同刺激原诱导的淋巴细胞增殖反应中,加入1C6的实验组细胞克隆明显减少,3H-TdR掺入量明显下降,细胞增殖受抑。结论1C6可抑制多种肿瘤细胞的生长,可介导补体杀伤多种靶细胞。1C6对抗CD3刺激的外周血淋巴细胞增殖以及混合淋巴细胞培养均具有明显的抑制效应。

巴利昔单抗联合鼠抗人CD3单克隆抗体在高致敏受者肾移植中的临床应用

目的:探讨巴利昔单抗与鼠抗人CD3单克隆抗体(OKT3)联合诱导在高致敏受者肾移植临床应用中的有效性及安全性。方法:术前2个月内群体反应性抗体(PRA)检测值均>50%的尸体供肾肾移植受者20例,其中9例受者接受巴利昔单抗联合OKT3免疫诱导(联合诱导组),11例受者接受OKT3常规免疫诱导(OKT3诱导组),均以他克莫司(Tac)+吗替麦考酚酯(MMF)+泼尼松(Pred)为基础免疫抑制方案,评估术后移植肾功能恢复情况、3个月内急性排斥反应发生率、1年内肺部感染发生率、1年人/肾存活率及移植肾功能。结果:联合诱导组、OKT3诱导组肾移植术后3个月内急性排斥反应发生率及术后1年内肺部感染发生率分别为11.1%vs.36.4%(P=0.319),11.1%vs.63.6%(P=0.028);联合诱导组患者术后1周内移植肾功能恢复正常比例明显高于OKT3诱导组(88.9%vs.27.3%,P=0.010);联合诱导组术后1年人/肾存活率均为100%,与OKT3诱导组(分别为90.9%、81.8%)比较,差异不显著(P=1.00和P=0.100);术后1年联合诱导组、OKT3诱导组血肌酐值分别为(105±24)、(97±22)μmol·L-1(P=0.437)。结论:巴利昔单抗联合OKT3进行免疫诱导,在预防高致敏受者术后早期排斥反应的同时,缩短了移植肾功能的恢复时间,是一种安全、有效的防治策略。