茵陈蒿提取物体外抗传染性支气管炎病毒的作用研究

为了探讨茵陈蒿提取物体外抗传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的作用及机制,试验采用人肺癌细胞(H1299细胞)和非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)作为供试细胞,分别在IBV感染前及感染后在细胞培养体系中加入茵陈蒿提取物,探索茵陈蒿是否具有抗IBV作用。再将茵陈蒿提取物以最大无毒质量浓度为起点,倍比稀释成不同质量浓度,观察不同质量浓度茵陈蒿提取物抗IBV作用。试验分为空白对照组、IBV组、病毒感染前加药组、病毒感染后加药组,在每组病毒感染H1299细胞24 h后收集细胞,提取总RNA并反转录合成cDNA,并采用一定体积免疫沉淀组织/细胞裂解液与苯甲基磺酰氟(PMSF)混合液裂解各组细胞提取总蛋白,采用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western-blot技术检测IBV感染细胞内凋亡相关基因Bad、Bcl-2、Fas和炎症相关因子NF-κB-p65、磷酸化NF-κB-p65(p-p65)、IL-6、IL-8的mRNA基因和蛋白表达情况,采用间接免疫荧光技术检测p-p65的核移位。结果表明:茵陈蒿提取物体外对IBV的复制具有一定的抑制作用,并呈剂量依赖性,体外最大无毒质量浓度为0.5 g/mL。与空白对照组相比,IBV组凋亡相关基因和炎症相关因子的表达水平均不同程度上调;与IBV组相比,病毒感染前加药组、病毒感染后加药组Fas、IL-6、IL-8(除病毒感染后加药组外)、NF-κB-p65 mRNA相对表达量显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01),Bad、Bcl-2、Fas、IL-6、IL-8、NF-κB-p65和p-p65蛋白相对表达量均明显下调;间接免疫荧光结果显示,茵陈蒿提取物处理抑制了p-p65核移位。说明茵陈蒿提取物体外具有抗IBV作用,该作用可能与其下调NF-κB信号通路相关炎症因子的表达及减轻IBV感染引起的宿主细胞凋亡有关。

抗传染性支气管炎病毒单克隆抗体的研究

经密度梯度离心法提纯鸡胚尿囊液中的传染性支气管炎病毒 H_(120),获得了较纯的 H_(120)抗原。运用细胞杂交瘤技术,共获得23株阳性杂交瘤细胞株。对23株阳性杂交瘤细胞株进行特异性鉴定,其中3株稳定分泌针对 IBV 的特异性单克隆抗体。3株单抗均为 IgG。经 Western Blotting 证明其中有1株针对 IBV M 蛋白,命名为 Mc。用单抗介导的间接免疫荧光抗体技术检测鸡胚尿囊细胞中 IBV 的方法测定 Mc 与 IBV 的反应谱,证明 Mc 反应谱较广,是1株 IBV 群特异性单克隆抗体。

抗传染性支气管炎病毒中药的研究

用细胞培养法、鸡胚培养法对车前子、麦冬等 4 0种中药进行抗传染性支气管炎病毒(IBV)的筛选试验。通过细胞病变 (CPE)抑制试验发现 ,石榴皮等 5种中药有抑制CPE的作用。培养细胞有 2 0 %发生CPE ,认为这些中药有抗IBV的作用。应用空斑形成抑制试验对 5种抗IBV中药进行复筛 ,结果表明 5种中药均有不同程度的抑制病毒空斑形成作用 ,其中以石榴皮等 2种中药作用较强 ,空斑形成抑制率可达 98%以上。应用鸡胚培养法对 5种中药进行抗IBV试验 ,结果发现 5种中药均显著地减少了鸡胚病变及胚体的死亡 ,其中以石榴皮等 2种中药抑制胚体病变的作用最强。通过不同加药时间观察到在接毒前 4 8h给药 ,有 2种中药具有明显抑制CPE的作用 ;接毒同时加药以及接毒后 1h加药 ,这 5种中药均能明显抑制CPE。

植物乙醇浸提物抗传染性支气管炎病毒活性检测及其机制初探

为明确刀豆、皂荚和蛇麻子植物乙醇浸提物抗传染性支气管炎病毒(IBV)的作用机制,试验以嵌合荧光素酶基因的病毒株IBV-3ab-luc为供试病毒,在感染人类肺癌H1299细胞2 h后,用刀豆、皂荚和蛇麻子乙醇浸提物处理细胞,24 h后检测荧光素值,同时利用RT-PCR分析刀豆、皂荚和蛇麻子对干扰素的调控作用,研究其抗病毒机制。结果表明:皂荚和蛇麻子乙醇浸提物对病毒复制均有不同程度的抑制作用,其中,蛇麻子乙醇浸提物的抑制作用最强,皂荚的作用次之,而刀豆乙醇浸提物无显著效果;另蛇麻子和皂荚乙醇浸提物可增强β干扰素RNA的转录水平。

抗传染性支气管炎病毒的植物乙醇提取物筛选

为筛选出抗传染性支气管炎病毒(IBV)效果较好的植物,试验采用嵌合荧光素酶基因的IBV-3ab-luc为供试毒株,以人类肺癌细胞H1299为供试细胞,在升麻、丹皮、千里光、续断、元胡、龙葵6种植物乙醇提取物处理H1299细胞之前、中、后的一定时间感染,24 h后通过检测荧光素酶值,研究不同植物乙醇提取物的抗病毒机制。结果显示:丹皮的对数值为3,千里光的对数值为2,龙葵的对数值为1,升麻、续断和元胡的对数值为0。说明丹皮乙醇提取物抗IBV活性最强,其次是千里光,龙葵较差,而升麻、续断和元胡几乎没有抑制效果。

抗传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

将IBV H120毒株通过接种鸡胚的方法扩繁,从含病毒的尿囊液中提取总RNA,RT-PCR扩增N基因,构建原核表达载体pGEX-6p-1-N.将测序正确的重组质粒转化入E.coli Transetta(DE3)感受态,对重组蛋白进行诱导表达并纯化,切除GST标签.采用纯化的N蛋白制备抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫效果最好的小鼠B淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合.利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆筛选出13株单抗,其中8株能与IBV结合.通过体内诱生腹水的方法对1A12C5细胞株进行大量制备,辛酸/硫酸铵方法对腹水进行纯化并鉴定.

抗传染性支气管炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

将传染性支气管炎病毒M41毒株通过接种鸡胚的方法扩繁,从含病毒的尿囊液中提取总RNA,RT-PCR扩增M基因,构建原核表达载体pGEX-6p-1-M,导入大肠杆菌Transetta(DE3)内诱导表达。将纯化后的重组M蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备能稳定分泌抗M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过小鼠体内诱生腹水的方法大量制备抗M蛋白的单克隆抗体,用辛酸/硫酸铵方法纯化腹水,并对纯化的单克隆抗体进行了鉴定。

10种中药提取物体外抗传染性支气管炎病毒效果的研究

采用体外细胞培养法,研究板蓝根、大青叶、黄连、菊花、淫羊藿、人参、茯苓、黄芪、山药和当归10种中药提取物在鸡胚成纤维细胞体外培养中的最大安全浓度,借助光学倒置显微镜,肉眼观察提取物对细胞形态的影响。在安全浓度范围内分别考察各味中药对传染性支气管炎病毒标准株M41型(IBV-M41)的防治效果,确定4种抗病毒力最强的4种中药进行后续的试验。结果表明,板蓝根、大青叶、黄连和淫羊藿对IBV-M41的抗病毒效果最好。

鸡基因组多个位点影响抗传染性支气管炎病毒感染

目前，关于宿主抗鸡传染性支气管炎病毒（IBV）感染的免疫应答的遗传机制知之甚少。广东省农业科学院畜牧研究所的科研人员应用ELISA试剂盒检测疫苗免疫后511份原鸡血清的IBV抗体水平，并应用全基因组关联研究鉴定影响抗IBV感染的免疫应答产生的主要位点。

抗传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

选取传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)M41毒株S1蛋白的重要抗原区,RT-PCR扩增选定的S1基因并构建pET-28a-S1重组表达载体,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE以及Western blot结果显示重组S1蛋白表达正确。以纯化的S1蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备并获得了抗IBV M41 S1蛋白的单克隆抗体3D9。免疫过氧化酶单层试验(immunoperoxidase monolayer assay, IPMA)结果显示,单克隆抗体3D9可与IBV M41毒株反应。成功表达了截短的IBV S1蛋白并获得了能识别IBV M41毒株的单克隆抗体,为IBV检测方法的建立奠定了基础。

抗鸡传染性支气管炎病毒中药的筛选

【目的】对鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)进行抗病毒中药的筛选,并验证其治疗效果,为临床用药提供一定参考。【方法】采用鸡胚培养法,通过预防和治疗2个角度对24味单一中药、6种市售复方中药进行抗IBV的有效成分或方剂筛选试验,即在SPF鸡胚中先注射中药2 h后再接种病毒和先接种病毒2 h后再注射中药。使用SPSS 20.0软件对鸡胚重量进行方差分析,利用实时荧光定量PCR法辅助判定治疗效果。【结果】对鸡胚净重进行方差分析显示,桔梗组与阳性对照组差异显著(P<0.05),与阴性对照组差异不显著(P>0.05),表明预防和治疗均有效果。实时荧光定量PCR检测鸡胚尿囊液病毒滴度结果显示,桔梗、鱼腥草、宣肺败毒方、绞股蓝、蒲公英、甘草对IBV增殖均有抑制作用,其中桔梗抑制效果最佳。【结论】桔梗对IBV有显著的预防及抑制效果,结果为深入研究桔梗作用机理提供了依据。

滑液囊支原体与鸡传染性支气管炎病毒共感染对SPF鸡的致病性研究

为比较滑液囊支原体(MS)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)共感染对SPF鸡的致病性,本研究将144只28日龄SPF鸡随机均分为阴性对照组、MS感染组、IBV-M41感染组、IBV-M41+MS共感染组、IBV-QX感染组、IBV-QX+MS共感染组共6组,采用50μL/只剂量按相应分组点眼感染MS (106CCU50)、IBV(105EID50),阴性对照组以50μL/只点眼KM2培养基(左眼)和PBS (右眼)。感染后每天观察临床症状,在感染后7 d、14 d、21 d和28 d每组随机剖检6只鸡,观察气囊炎和气囊损伤评分,并采集气管进行病原再分离,其中MS经支原体液体培养基培养后进行PCR鉴定,IBV接种SPF鸡胚后进行RT-PCR鉴定。此外,各组鸡气管均经10%甲醛固定后进行粘膜厚度检测以及病理损伤评分。结果显示:除阴性对照组和MS感染组,其他组鸡在感染后4 d均出现一过性呼吸道症状。剖检结果显示MS感染组鸡在感染后21 d出现气囊炎,28 d仍可见气囊炎;而IBV-M41感染组和IBV-QX感染组鸡在感染后7 d或14 d出现气囊炎,且气囊炎的发生率均未超过50%。感染后14 d IBV-QX+MS共感染组鸡气囊炎发生率达100%(6/6),直至21 d并且大部分鸡气囊炎可持续至感染后28 d (5/6),而IBV-M41+MS共感染组鸡气囊炎仅可持续至感染后21 d,且气囊炎的发生率最高在感染后14 d (5/6)。IBV-QX+MS共感染组鸡平均气囊损伤评分在感染后14 d、21d和28 d均极显著高于单一感染组(P<0.001),而IBV-M41+MS共感染组鸡仅在感染后14 d极显著高于单一感染组(P<0.001)。病原再分离结果显示,各感染组鸡均在气管中再分离到MS(感染后28 d内)或IBV(感染后7 d内)。病理损伤检测结果显示,共感染组鸡较各单一感染组鸡气管粘膜增厚持续时间更长以及病理损伤更为严重。IBV-M41+MS共感染组鸡在感染后14 d平均气管粘膜厚度显著低于IBV-QX+MS共感染组(P<0.05),而在感染后21 d极显著低于IBV-QX+MS共感染组(P<0.001),其余各组鸡在感染后14 d和21 d均极显著低于IBV-QX+MS共感染组鸡(P<0.001)。IBV M41+MS共感染组鸡最早14 d出现气管病变,而IBV QX+MS共感染组鸡在共感染后7 d就可见气管病理损伤,且共感染组鸡的平均气管损伤评分均极显著高于单一MS或IBV感染组(P<0.01或P<0.001)。上述结果证实MS和IBV共感染较单一感染对28日龄SPF鸡的致病性更强,IBV M41或QX株与MS共感染对SPF鸡的致病性存在差异,本研究为临床IB和MS的防控提供科学参考依据。

传染性支气管炎病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

本研究以IBV Beaudette株基因组为模板获得N基因片段,构建重组原核表达质粒pET-32a-His-IBV-N,在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,纯化后获得带有His标签的N重组蛋白。将其与等体积的弗氏完全佐剂混匀乳化后免疫BALB/c小鼠3次,收集血清,得到鼠源抗N蛋白多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验和Western blot鉴定多克隆抗体的特异性。结果显示,N蛋白多克隆抗体能特异性识别转染表达的Flag-N蛋白和IBV感染表达的N蛋白,说明此抗体能识别N蛋白的线性表位和空间表位,可应用于Western blot和间接免疫荧光实验。本研究为进一步研究N蛋白的功能和IB的诊断提供了技术支撑。

鸡传染性支气管炎病毒组织和细胞嗜性分子机制研究进展

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起鸡的传染性支气管炎(IB)可导致鸡呼吸系统、泌尿系统、生殖系统、消化系统的组织病变,不同IBV毒株的组织嗜性及相应细胞嗜性存在差异。病毒基因组上关键基因或位点通过影响病毒复制周期完整性决定组织嗜性或宿主嗜性,位于IBV S1和S2亚基上的单个或多个位点均能决定其组织嗜性和细胞嗜性,但需要进一步探究这些关键位点改变病毒与宿主互作过程的机制;其他基因对IBV组织和细胞嗜性的影响亟待研究。论文就近年来影响IBV组织和细胞嗜性差异的相关分子机制研究进展进行综述,旨在为IBV致病机制、重组疫苗、抗病毒药物等的进一步研究提供参考。

一株GⅠ-19基因型禽传染性支气管炎病毒基因序列分析及致病性研究

为了解传染性支气管炎病毒(IBV)的遗传变异及致病性,试验对江苏某鸡场发病鸡进行病原分离和鉴定,并对分离株S1基因进行同源性、遗传进化树、糖基化位点、S蛋白裂解位点和致病性分析。结果显示:从发病鸡肾脏组织中分离并鉴定到1株IBV,该分离株经SPF鸡胚盲传5代后,可引起典型的侏儒胚特征病变,其S1基因大小为1620 bp,分离株被命名为CK/CH/WJ215;CK/CH/WJ215与GⅠ-19基因型毒株S1核苷酸序列相似性为94.3%,与流行优势基因型GⅠ-19属于同一分支;RDP4重组分析显示该分离株S1蛋白不存在重组事件;进一步糖基化位点分析表明,与常用疫苗株相比,CK/CH/WJ215 S1蛋白在第51、77、103、138、163、178、247、276、283、530位点出现变异,值得注意的是,与H120疫苗株和QXL87疫苗株相比,CK/CH/WJ215 S1蛋白分别在138和530位出现了新的糖基化位点;7日龄SPF鸡致病性试验显示,该分离株可导致SPF鸡100%(15/15)发病,66.7%(10/15)死亡,并且导致严重的肾脏病变;感染鸡从第2天开始持续排毒,直到第21天气管和泄殖腔排毒率仍为80%(4/5)和100%(5/5)。研究表明,从江苏某鸡场发病鸡群种分离的GⅠ-19基因型IBV对SPF雏鸡具有很强的致病性,结果为该地区传染性支气管炎流行病学及防控提供参考。

植物精油对传染性支气管炎病毒人工感染雏鸡的防治效果

旨在探讨植物精油(商品名:舒柠500)对禽传染性支气管炎病毒(IBV)人工感染雏鸡的防治效果。将260羽1日龄健康非免疫雏鸡分成空白组、模型对照组(A、B、C)、预防组(A、B、C)、治疗组(A、B、C)和阳性药物组(A、B、C)共13组,每组20只。除空白组外,其余各A组雏鸡均在8日龄单感染IBV毒株GX-QZ20181028(LX4型),各B组雏鸡均在8日龄单感染IBV毒株GX-NN20200723(Taiwan型),各C组雏鸡均在8日龄共感染IBV毒株GX-QZ20181028(LX4型)和GX-NN20200723(Taiwan型)。预防组在3日龄(感染前5 d)饮水给药(植物精油,1 mL·L^(-1)水);治疗组(植物精油1 mL·L^(-1)水)和阳性药物组(双黄连口服液,0.7 mL·L^(-1)水)均在感染后半数以上的雏鸡表现临床症状时给药治疗,连续给药5 d。在雏鸡8、9、13、14、15、16、17、18、19、20日龄时,评定临床症状计分与疗效;在雏鸡19、22日龄时,观察病理组织学病变、测定免疫器官指数并检测气管和肾脏病毒载量;在雏鸡8、9、15、17、19、22日龄时,对IBV特异性抗体和血清中细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-6进行检测。结果显示,预防组A、B和C的保护率分别为75.00%、85.00%和70.00%;治疗组A、B、C的有效率分别为92.31%、78.57%、77.78%。模型对照组雏鸡可见大量气管黏膜上皮细胞纤毛减少或消失,并发生变性坏死,肾间质淋巴细胞浸润,其余组均无明显病变。预防组、治疗组和阳性药物组气管和肾组织病毒载量均显著低于模型对照组(P<0.05)。模型对照组胸腺与法氏囊指数显著低于其余各组(P<0.05)。17日龄(给药后第5天),预防组、治疗组、阳性药物组抗体水平上升,至22日龄(停药后第5天),抗体水平显著高于模型对照组(P<0.05)。13至22日龄(给药前至停药后第5天),模型对照组的IL-4、IFN-γ含量均显著低于其余各组(P<0.05),但IL-6含量显著高于其余各组(P<0.05)。综上,在本试验条件下,植物精油对IBV单感染和共感染雏鸡均有较好的防治作用,其防治作用主要通过抑制病毒复制、促进免疫器官发育和抗体生成、调节细胞因子来实现。本研究为禽传染性支气管炎(IB)防治提供新思路,也为其它动物冠状病毒病有效防治提供了参考。

2株重组禽传染性支气管炎病毒的分离鉴定及基因组序列分析

【目的】了解禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的遗传变异情况。【方法】采集山东地区部分养殖场中疑似IBV感染鸡病料组织,接种SPF鸡胚进行病毒分离鉴定,利用二代测序技术进行全基因组测序鉴定,并基于全基因组序列进行遗传进化和关键氨基酸位点分析。【结果】感染鸡剖检可见气管环出血,管腔内有黄色或黑黄色栓塞物等。从病料中共分离获得2株IBV,分别命名为SDJN和SDLY。相似性分析结果显示,分离株SDJN和SDLY与GⅠ-19基因型参考毒株相似性较高,核苷酸序列相似性为96.0%~97.3%,氨基酸序列相似性为94.9%~100%。氨基酸序列分析结果显示,2株IBV分离株与其他毒株相比存在多个氨基酸变异位点。系统进化树结果显示,分离株SDJN和SDLY与IBV GⅠ-19基因型参考毒株位于同一分支。重组分析结果显示,分离株SDJN和SDLY为多种基因型毒株的重组毒株,均以ck/CH/LDL/091022株为主要亲本毒株。【结论】本研究从山东地区分离得到2株IBV,2株分离株与GⅠ-19基因型毒株密切相关,是一种新型重组IBV毒株。研究结果为进一步研究IBV流行与进化及禽传染性支气管炎的防控奠定基础。

Viperin通过胆固醇影响禽传染性支气管炎病毒复制

Viperin是一种干扰素诱导因子,具有广泛的抗病毒作用。为探究Viperin是否通过胆固醇发挥抗禽传染性支气管炎病毒(IBV)的作用,本试验通过消耗或添加细胞膜胆固醇,分析胆固醇对IBV复制的影响;并分别在细胞中过表达和干扰表达Viperin,评估Viperin对细胞胆固醇含量和IBV复制的影响,并分析Viperin、胆固醇含量和IBV复制三者之间的关系。结果显示,在IBV感染后48 h,与IBV感染组相比较,使用5.0和10.0 mmol/L甲基-β-环糊精(MβCD)消耗细胞膜胆固醇后IBV复制被极显著抑制(P<0.001),添加5.0 mg/mL外源性胆固醇后IBV复制被极显著促进(P<0.001),消耗细胞膜胆固醇后再添加外源性胆固醇,IBV复制被抑制后恢复至接近正常水平(P>0.05);在IBV感染后24和48 h,与IBV感染组相比较,过表达Viperin可极显著降低细胞中胆固醇含量(P<0.001),并极显著抑制IBV复制(P<0.001);在IBV感染后6和48 h,与IBV感染组相比较,干扰表达Viperin可显著提高细胞中胆固醇含量(P<0.05或P<0.001);在IBV感染后24 h,与IBV感染组相比较,干扰表达Viperin可极显著促进IBV复制(P<0.001);在IBV感染后48 h,与IBV感染组相比较,过表达Viperin后再添加外源性胆固醇可恢复IBV复制(P>0.05)。结果表明,细胞膜中胆固醇水平与IBV复制密切相关,且Viperin可通过调节细胞胆固醇抑制IBV复制。本试验为寻找IBV新的抗病毒靶点提供理论依据和新思路。

三株鸡传染性支气管炎病毒优势流行毒株全基因组分析及其致病性

为调查研究禽传染性支气管炎病毒(IBV)的流行及优势毒株致病特性,本研究对实验室分离的IBV毒株进行了遗传演化研究和致病性研究,旨在了解我国当下IBV流行毒株基因型、生物学特性以及为新疫苗的研制提供借鉴参考。首先对56株IBV分离毒株S1全长核苷酸序列进行遗传演化分析,从中挑选了MH20、KC和JS96 3株优势基因型毒株进行全基因组测序分析,然后选取毒力较强的JS96毒株进行了SPF鸡致病性试验。结果表明:遗传演化分析结果显示GI-19是我国主要流行毒株,占比约53.57%,同时变异毒不断涌现,GVI(新基因型)明显的流行增多。3株优势基因型分离毒株的全长基因组与QX-like毒株相似性最高,达到97%以上,但与国内外疫苗株、经典毒株的相似性低,仅为77%左右。抗原表位分析同样表明了分离株与疫苗毒株、经典毒株的B细胞抗原表位数量和序列都存在差异。3株分离毒株均可导致SPF鸡胚矮化和致死,其中JS96对1日龄SPF鸡的致病率高于15日龄SPF鸡,1日龄SPF鸡100%死亡率,15日龄SPF鸡出现生长显著迟缓和个别鸡症状明显,发病鸡剖检均可见“花斑肾”。本研究表明,QX-like基因型IBV毒株是现下IBV的主要流行毒株,对低日龄鸡致病性强,易发生基因重组,与疫苗毒株、经典毒株S蛋白相似性低,适配性较差,急需选择合适疫苗及研发新型疫苗,才能控制当下IBV疫病流行,减少养禽业的损失。

禽传染性支气管炎病毒感染性克隆的快速构建及应用

为构建高效且易于操作传染性支气管炎病毒(IBV)基因组的反向遗传学平台,本研究将IBV H120株全基因组经RT-PCR分段扩增,并在其基因组的5'端引入人巨细胞病毒(CMV)启动子序列以及3'端引入丁型肝炎病毒核酶序列(HDVRz)和牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号序列(后续称HB序列),获得H120株基因组的9个片段(CMV-F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8和F9-HB);其中片段F7通过引物引入沉默突变C20356T作为遗传标记。采用转化偶联重组(TAR)克隆技术将9个DNA片段与线性质粒p YES1L转化酿酒酵母细胞,快速构建H120株基因组全长cDNA克隆,经连接PCR(Junction-PCR)筛选及测序鉴定获得感染性克隆质粒p YES1L-H120。为了提高病毒拯救效率,同时构建表达IBV N蛋白的辅助质粒pcDNA3.1-N+3'UTR。将p YES1L-H120与pcDNA3.1-N+3'UTR共转染BHK-21细胞,48 h后收获细胞,接种9日龄SPF鸡胚盲传3代,经胚体病变观察和测序显示获得IBV反向遗传重组病毒r H120株。为了以IBV为载体表达外源基因,本研究将病毒基因组的5a基因替换为eGFP基因,采用TAR克隆技术构建以IBV为载体表达外源e GFP基因的cDNA克隆pYES1L-H120-Δ5a-eGFP,与辅助质粒共转染BHK-21细胞,随后接种SPF鸡胚拯救嵌合病毒r H120-Δ5a-eGFP,并采用PCR和测序鉴定该重组病毒正确构建。结果显示,采用TAR克隆技术能够在短时间内获得IBV反向遗传重组病毒且快速操作病毒基因组获得以IBV为载体稳定表达外源基因的嵌合病毒。本研究首次建立了基于TAR克隆技术的IBV反向遗传操作平台,为研究病毒的生物学特性、载体疫苗的开发和抗病毒药物的筛选提供高效便捷的工具。