静注人免疫球蛋白抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用测定方法的建立

目的利用转录报告基因细胞,建立静注人免疫球蛋白(pH4)(human Immunoglobulin(pH4)for Intravenous Injection,IVIG)抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)生物学活性测定方法。方法以Jurkat-NFAT-Luc-CD16细胞作为效应细胞,PLC/PRF/5细胞作为靶细胞,将效应细胞、靶细胞和IVIG孵育后,通过检测IVIG Fc段结合效应细胞后活化T细胞核因子释放的荧光素酶,建立IVIG ADCC生物学活性检测方法,同时对试验条件进行优化,以及对该方法进行方法学验证。结果IVIG在该方法中存在量效关系,符合四参数方程。经过试验条件优化,最终确定将PLC/PRF/5细胞作为靶细胞,抗体起始稀释浓度为20 mg/mL,梯度稀释倍数为1∶2,效靶比为1∶3,效应细胞、靶细胞和IVIG共同孵育时间为24 h。三次独立检测的日内和日间起始工作浓度荧光素酶相对光单位(relative light unit,RLU)及半最大效应浓度(concentration for 50%of maximal effect,EC50)的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<11%,2个不同稀释组回收率样本相对效价分别(23.50±1.69)%,(49.30±2.97)%,对应的回收率分别为(93.50±6.30)%,(96.24±5.43)%,RSD均<11%。结论本研究利用转录报告基因细胞成功建立IVIG ADCC生物学活性检测方法,该方法具有专属性强、重复性好、准确性高等优点,可作为IVIG ADCC生物学活性检测方法。

抗体依赖细胞介导的细胞毒性抗肿瘤研究进展

近年来,随着单克隆抗体临床应用的逐渐增加,抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)的抗肿瘤效果日益受到重视。自然杀伤细胞(NK细胞)是介导ADCC特异性抗肿瘤最主要的效应细胞,而吞噬细胞、T细胞及粒细胞对ADCC抗肿瘤效应也有一定作用。ADCC被证明是单克隆抗体临床治疗肿瘤的重要机制和手段,IgG型抗体首先通过抗原结合部位与靶细胞(肿瘤细胞)结合,再由效应细胞上的FcγR识别其Fc段,介导ADCC。已投入临床应用的单克隆抗体有:利妥昔单克隆抗体及新型的抗CD20单克隆抗体、曲妥珠单克隆抗体、西妥昔单克隆抗体、依决洛单克隆抗体、尼妥珠单克隆抗体及吉妥单克隆抗体,这些单克隆抗体均具有ADCC抗肿瘤作用。单克隆抗体介导的ADCC抗肿瘤疗效受多方面因素影响,包括:IgGFc受体的基因多态、肿瘤细胞抗原、血清抗体水平、细胞因子及药物等。FcγRIIIa-158V/V基因型和FcγRIIa-131H/H基因型比其他基因型的外周血单个核细胞的ADCC作用更强。提高肿瘤抗原水平,降低血清抗体水平或增加某些细胞因子(如IL-2,IL-21,IL-15等)均可提高单克隆抗体的ADCC作用,而避免使用某些药物(如地塞米松、肿瘤坏死因子拮抗剂)或适当使用昂丹司琼和氯马斯汀也可增强单克隆抗体的ADCC抗肿瘤作用。总之,ADCC抗肿瘤的临床应用十分重要,但效果会受多方面因素的影响。本文就ADCC杀伤机理、临床常用的和已投入临床使用的具有ADCC抗肿瘤效应的单克隆抗体,影响ADCC抗肿瘤效率的因素及其他细胞ADCC的抗肿瘤作用进行了综述。

人参皂甙和肿瘤坏死因子对小鼠脾细胞抗体依赖细胞介导的细胞毒活性的影响

抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)在机体抗肿瘤和抗病毒感染中起重要作用。研究报道人参皂甙和肿瘤坏死因子(TNF)以及它们联合应用对小鼠脾脏细胞 ADCC作用的影响。结果表明:人参皂甙和 TNF 在体内和体外均能增强小鼠脾细胞的 ADCC 作用,与对照组比较差异非常显著(P<0.01)。两者联合应用时不论在体内或体外,均有明显协同作用(P<0.01,P<0.05)。

针药结合对Graves'眼病患者血清眼外肌抗体依赖细胞介导的细胞毒作用

为探讨针药结合治疗Graves 眼病 (GO)的免疫学机理 ,5 4例GO患者随机分为治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组和对照组各 18例 ,测定治疗前后患者血清对人眼外肌抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)作用及血清抗眼肌膜抗体 (EMAb)的水平。结果 :治疗后患者血清对眼外肌的ADCC作用较治疗前明显降低 ,且治疗Ⅱ组低于对照组 (P <0 0 5 ) ;血清EMAb水平在针刺治疗后明显降低 (P<0 0 5 ,P <0 0 0 1) ;针刺Ⅱ组水平低于Ⅰ组和对照组 (P <0 0 1,P <0 0 0 1)。提示针药结合治疗Graves 眼病的眼肌损伤可能与降低EMAb ,减轻对眼外肌的ADCC有关。

抗丝虫感染的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用

对丝虫微丝蚴和感染期幼虫的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)可能是宿主抗丝虫感染的主要免疫效应机制。参与作用的抗体类型和效应细胞可因虫种而异。效应细胞通过其细胞膜上的Fc受体与结合于虫体表面的抗体Fc段桥连,进而释放各种毒性物质作用于虫体,导致虫体死亡。抗体和补体同时存在时,效应细胞能对虫体发挥最大的杀伤效应,效应细胞表面的补体受体在其中起了重要作用。另外,补体还能单独介导效应细胞实施对虫体的攻击。

基于实验设计的抗PD-1/PD-L1单抗报告基因抗体依赖细胞介导的细胞毒效应生物学活性优化及验证方法的建立

目的利用实验设计(design of experiment,DOE)建立抗程序性死亡因子1(programmed cell death 1,PD-1)及其配体(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)单抗基于报告基因的抗体依赖细胞介导的细胞毒效应(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)生物学活性优化及验证方法。方法利用Jurkat-hFcγRⅢa-NFAT转基因细胞系作为效应细胞,分别以293FT-PD-1细胞系和CHO-PD-L1细胞系作为靶细胞,通过荧光素酶检测系统(Bright GloTM Luciferase Assay system)建立抗PD-1/PD-L1单抗的ADCC生物学活性检测方法,并运用DOE方法进行试验优化和方法学验证。结果抗PD-1/PD-L1单抗在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D,方法经优化后确定抗体量效范围分别为10 000~4. 833 ng·m L^-1和2 000~0. 488 ng·m L^-1,效靶比(effect target ratio,E∶T)为分别为6∶1和3∶1,诱导时间均为20 h。该方法具有良好的专属性;抗PD-1单抗4个不同稀释组回收率样本经3次检测,相对效价分别为(51. 74±2. 22)%、(77. 12±3. 14)%、(118. 71±2. 83)%和(156. 20±12. 99)%;对应的回收率分别为(103. 49±4. 44)%、(102. 83±4. 19)%、(94. 96±2. 26)%和(104. 14±8. 66)%,抗PD-L1单抗4个不同稀释组回收率样本经3次检测,相对效价分别为(54. 32±4. 75)%、(75. 24±4. 25)%、(127. 40±2. 43)%和(156. 82±3. 27)%;对应的回收率分别为(108. 64±9. 51)%、(100. 33±5. 67)%、(101. 92±1. 94)%和(104. 55±2. 18)%,上述结果的RSD均小于10%。结论本实验利用DOE设计成功建立基于报告基因的抗PD-1/PD-L1单抗ADCC生物学活性的优化及验证方法,该方法专属性强、重复性好,准确性高,可作为抗PD-1/PD-L1单抗ADCC生物学活性的评价方法。

抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应在哮喘发病机制中的作用

目的 :进一步探讨支气管哮喘发病机制。方法 :建立小鼠哮喘模型 ,分离哮喘鼠和正常鼠脾脏各种免疫细胞 ,包括单核 /巨噬细胞 (M)、树突状细胞 (DC)、B细胞、CD3+ T细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞 ,并以细胞增殖法和改良的MTT比色法[1 ] 检测了上述各种细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应 (ADCC)。结果 :哮喘小鼠M自然状态下ADCC作用弱于对照组 (P <0 0 5) ;哮喘小鼠B细胞自然状态下ADCC作用弱于对照组 (P <0 0 5) ;哮喘小鼠T细胞及其亚群自然状态下ADCC作用弱于对照组 (P <0 0 5) ;哮喘小鼠树突状细胞自然状态下ADCC作用与对照组无显著差异 (P <0 0 5)。结论 :在小鼠哮喘模型中 。

FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用杀伤A549细胞的影响

目的探讨FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)作用杀伤A549细胞的影响。方法选取肺腺癌A549细胞作为靶细胞,NKTm细胞为效应细胞。基因测序法检测NKTm细胞FCGR3A基因多态性,CCK-8法检测西妥昔单抗介导NKTm细胞的ADCC活性。结果 NKTm细胞FCGR3A具有基因多态性,分别为V/V、V/F及F/F表型。西妥昔单抗介导3种表型的NKTm细胞的ADCC活性差异具有统计学意义(P=0.0015),其中FCGR3A-158V/V表型的NKTm细胞的ADCC活性比V/F及F/F表型强(P<0.01),而V/F与F/F表型的NKTm细胞ADCC活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论西妥昔单抗介导的NKTm细胞ADCC活性与FCGR3A基因多态性有关。

比色法检测抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性在消化道癌症中的应用

人外周血单个核细胞中的K细胞,单核细胞等,具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC);在抗感染、移植免疫和肿瘤免疫以及自身免疫病中起重要作用,测定AD-CC活性可了解机体免疫功能,对疾病疗效观察及预后有重要作用,目前ADCC活性测定最常用的方法是溶血空斑形成试验,Cr释放法等,以上方法操作复杂,有放射性污染,为此我们运用比色的方法测定了正常人及临床确诊为癌症病人的ADCC活性。

抗体依赖细胞介导的细胞毒作用在利妥昔单抗耐药机制中的研究进展

利妥昔单抗是一种在B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）中广泛应用的单抗类靶向药物,作用于CD20抗原.其联合化疗显著改善了B细胞淋巴瘤患者的预后.但是仍有部分患者对利妥昔单抗治疗无效或在治疗有效后短期内复发,提示可能存在利妥昔单抗的耐药.利妥昔单抗对B细胞淋巴瘤细胞的杀伤机制主要包括直接诱导凋亡、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖细胞毒作用（CDC）等,不同的作用机制可能存在不同的耐药机制,其中哪一种发挥了主要作用尚不明确.文章对利妥昔单抗ADCC作用机制中可能存在的影响疗效的因素进行综述.

改良TMB比色法替代^(51)Cr释放法检测抗体依赖细胞细胞毒效应研究

目的建立一种无致癌性、无放射性、灵敏的33,’,55,’-四甲基联苯胺(TMB)检测ADCC实验中靶红细胞自然释放的微量Hb含量的改进方法。方法利用Hb类似过氧化物酶效应催化双氧水氧化33,’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB),使其发生显色反应,改进吸光度在600 nm处的检测体系。采用Nycodenz密度渗透压介质分离单核细胞作为ADCC的效应细胞。比较2种情况的灵敏度,并与51Cr释放法进行方法学对照。在ADCC实验中,分别用51Cr释放法和改良TMB法测定Hb自然释放率。结果显色反应结束后加硫酸酸终止测定最大吸收波长移至450 nm,不加酸终止测定波长为600 nm。不加硫酸终止的TMB法检测Hb低检出限是0.0075 g/L,显色时间20min,TMB最优浓度是0.62 g/L,空白吸收始终稳定的维持在<0.003的较低值。而加酸终止的TMB法低检出限仅为0.5 g/L。显然不加酸终止的改良TMB法的灵敏度非常显著地高于加酸终止的TMB法。在测定ADCC靶红细胞自然释放率试验中,不加酸终止的改良TMB法仅需4 h孵育时间以及2.5×106 cell/ml红细胞浓度即可测定出释放Hb含量,而加酸后孵育时间要长达14 h并且需要更高浓度的红细胞才能测出自然释放Hb含量。用不加硫酸终止的TMB法检测ADCC活性与51Cr释放法相关性良好(r=0.999)。结论改良TMB比色法可以代替51Cr释放法检测ADCC的靶红细胞细胞毒效应。加酸终止、测定波长为450 nm的TMB比色法的灵敏度与51Cr释放法的灵敏度有显著差距,不适用低活性ADCC效应检测。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性与血清IgG含量相关性的初步探讨

为探索抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性与血清IgG含量的相关性，用微量比色法检测人外周血单个核细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性，用琼脂单相扩散试验测定人血清中IgG含量，对32例患者的外周血进行试验，测定其细胞毒活性及血清IgG含量。实验结果相关性分析，两者具有显著相关性（r=0．57，P〈0．01）。机体血清的IgG含量高低可能影响抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性的发挥。

单克隆抗体介导对细粒棘球蚴原头节细胞毒作用的体外试验

用抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)试验在体外观察了单克隆抗体对细粒棘球蚴原头节的杀伤作用。原头节在1C_2、2E_3、3E_8、3F_(10)、3C_2 5株单抗浓缩上清(1:5)及嗜酸性粒细胞存在情况下培养40小时,发育抑制率分别为100％,100％,100％,100％,57％;死亡率分别为100％,100％,100％,96％和14％。这一结果显示我们所获单抗中部分具有较强保护性,为寻求保护性抗原提供了线索,同时表明ADCC是宿主获得性抵抗力的重要组成部分。

HBs／CD3双特异性抗体介导LAK对HBVDNA转染细胞的细胞毒作用

双持异性抗体已应用于导向LAK细胞杀伤胃癌细胞、肝癌细胞、人免疫缺陷病毒(HIV)感染细胞，是继单克隆抗体之后又一重大进展。本研究应用化学偶联方法合成HBs/CD3双特异性抗体，并观察其对LAK细胞的细胞毒性怍用影响。用化学偶联剂SPDP将鼠源的CD3与HBs单克隆抗体连接得到HBs／CD3双特异性抗体。以LAK细胞为效应细胞，HBV DNA转染的2.2.15细胞为靶细胞。设HepG-2和K562细胞为对照组。实验显示，HBs／CD3双特异性单克窿抗体能显著提高LAK细胞与2．2．15细胞结合率；应用^125I-UdR释放试验检铡细胞毒性发现双特异性抗体能增强LAK细胞对2.2.15细胞的细胞毒性并且与抗体浓度相关，BsAb浓度递增．细胞毒性作用随之增加．对细胞毒性作用的特异性研究表明．加入HBs／CD3BsAb后。LAK细胞对2.2.15细胞毒性显著高于HepG-2和K562细胞组。上述结果表明。HBs／CD3双特异性抗体具有双向识别LAK细胞和2．2．15细胞特性。特异地促进LAK细胞与靶细胞结合，发挥选择性细胞毒性作用．

关于“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”的商榷

免疫学是一门深入到分子水平的生物学科,其概念的理解是比较困难的.在<免疫学基础与病原生物学>教材 (第三版,肖运本主编 )第一章第二节"免疫细胞"中讲到 K细胞的功能,文中叙述"抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用",笔者认为这一概念比较模糊,现就 K细胞的作用提出笔者的一点看法.

活性氮介导的抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用离体杀伤肝片吸虫童虫的机制

大鼠再次感染肝片吸虫后24-48小时内即可在肠壁和腹腔杀虫。腹腔单核/巨噬细胞是杀伤虫体的主要效应细胞之一,其杀伤效应依赖特异性抗体。本文首次报道抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用杀伤肝片吸虫童虫的机制。

嗜中性粒细胞及单核细胞介导的细胞毒效应在旋毛虫病免疫机理中的作用

目的探讨嗜中性粒细胞(Neutrophil,Neu)、单核细胞(Monocyte,Mon)介导的细胞毒效应在旋毛虫病免疫机理中的作用。方法采用ELISA检测总IgE、特异性IgE、总IgG和特异性IgG,然后取IgE和IgG高检测值时相的血清为免疫血清,以CO2培养法观察免疫血清对Neu、Mon杀伤旋毛虫肌幼虫的影响。结果大鼠感染旋毛虫后2周和3周,血清特异性IgE最高,感染后5周,特异性IgG阳性率最高。在免疫血清存在时,无论感染鼠还是正常鼠的Neu和Mon对旋毛虫幼虫均有很强的杀伤作用,但感染鼠Neu的作用更强。孵育48 h时,Neu和Mon对旋毛虫肌幼虫的杀伤率分别为42.1%和23.0%。结论大鼠感染旋毛虫后,血清总IgE与特异性IgE、总IgG与特异性IgG同步增加;在免疫血清存在的情况下,Neu和Mon均有杀伤旋毛虫肌幼虫的作用,但感染鼠Neu的作用更强;Neu和Mon发挥杀伤旋毛虫肌幼虫作用时主要依赖的是IgG。

FcγRIIIa基因多态性对利妥昔单克隆抗体介导的NK细胞杀伤Raji细胞作用的影响

由于FcγRIIIa的基因多态性可导致NK细胞上Fcγ受体(Fcgamma receptor,FcγR)与抗肿瘤单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)Fc段结合的亲和力不同,NK细胞以抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-depend-ent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)对肿瘤细胞的杀伤能力也不同。本研究通过CFSE-PI双荧光染色法检测不同FcγRIIIa基因型的NK细胞对Raji细胞的ADCC效应强度,确定不同FcγRIIIa基因型的NK细胞所介导的AD-CC效应差异。用nest-PCR测定FcγRIIIa表型,用CFSE-PI双荧光染色法染色靶细胞(Raji细胞),用流式细胞术检测NK细胞上CD3-CD56+及FcγRIIIa的表达以及Raji细胞上CD20的表达,计算细胞毒性。结果表明:FcγRIIIa-158V/V基因型的NK细胞ADCC细胞毒性指数为(69.05±2.38)%,FcγRIIIa-158V/F基因型的NK细胞ADCC细胞毒性指数为(39.63±3.86)%,与V/V基因型相比,V/F基因型的NK细胞对Raji细胞的ADCC效应明显较弱,差异具有统计学意义(t=12.950,p=0.000)。结论:FcγRIIIa基因多态性可影响利妥昔单克隆抗体介导的NK细胞对Raji细胞的体外ADCC效应,以FcγRIIIa-158V/V基因型的NK细胞ADCC效应较FcγRIIIa-158V/F基因型的NK细胞ADCC效应强。

体外研究抗CD20单克隆抗体对骨髓瘤细胞的细胞毒性作用

目的 :体外探讨上调多发性骨髓瘤 (MM)细胞表面CD2 0抗原表达后 ,抗CD2 0单克隆抗体美罗华对骨髓瘤细胞的细胞毒性作用。方法 :将浓度为 (0 - 80 0 )× 10 3 U/L的重组人干扰素γ(hrγ -IFN) ,分别与 10例初治(初治组 )和 10例复发难治 (难治组 )的MM患者瘤细胞共同培养 ,流式细胞仪测定培养前后瘤细胞表面CD2 0的表达 ;应用MTT比色法分析不同浓度美罗华对CD2 0抗原表达上调后瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用 (AD CC)和补体依赖性细胞毒作用 (CDC)。结果 :hrγ -IFN浓度分别≥ 5× 10 4U/L或≥ 1× 10 5U/L ,可明显增加初治组或难治组瘤细胞表面CD2 0的表达 ,在用 8× 10 5U/Lhrγ -IFN上调瘤细胞表面CD2 0抗原的表达后 ,12mg/L和 16mg/L的美罗华分别能显著介导初治组和难治组效应细胞对MM瘤细胞的ADCC和激活CDC。结论 :体外hrγ -IFN上调MM瘤细胞表面CD2 0的表达后、抗CD2