静注人免疫球蛋白抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用测定方法的建立

目的利用转录报告基因细胞,建立静注人免疫球蛋白(pH4)(human Immunoglobulin(pH4)for Intravenous Injection,IVIG)抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)生物学活性测定方法。方法以Jurkat-NFAT-Luc-CD16细胞作为效应细胞,PLC/PRF/5细胞作为靶细胞,将效应细胞、靶细胞和IVIG孵育后,通过检测IVIG Fc段结合效应细胞后活化T细胞核因子释放的荧光素酶,建立IVIG ADCC生物学活性检测方法,同时对试验条件进行优化,以及对该方法进行方法学验证。结果IVIG在该方法中存在量效关系,符合四参数方程。经过试验条件优化,最终确定将PLC/PRF/5细胞作为靶细胞,抗体起始稀释浓度为20 mg/mL,梯度稀释倍数为1∶2,效靶比为1∶3,效应细胞、靶细胞和IVIG共同孵育时间为24 h。三次独立检测的日内和日间起始工作浓度荧光素酶相对光单位(relative light unit,RLU)及半最大效应浓度(concentration for 50%of maximal effect,EC50)的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<11%,2个不同稀释组回收率样本相对效价分别(23.50±1.69)%,(49.30±2.97)%,对应的回收率分别为(93.50±6.30)%,(96.24±5.43)%,RSD均<11%。结论本研究利用转录报告基因细胞成功建立IVIG ADCC生物学活性检测方法,该方法具有专属性强、重复性好、准确性高等优点,可作为IVIG ADCC生物学活性检测方法。

绿原酸碳基材料的荧光性质及细胞毒性

以绿原酸(CA)为碳源,通过溶剂热法一步合成绿原酸衍生的碳基发光材料CA-71。借助荧光光谱、细胞共聚焦成像及细胞活力实验,进行CA-71荧光性质及细胞毒性研究。结果表明,绿原酸碳基材料CA-71荧光发射光谱具有激发依赖特性,最大激发波长为400 nm,对应的发射波长为492 nm。共聚焦成像实验进一步显示,CA-71能够通透细胞膜,定位人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内线粒体,与线粒体绿色定位染料高度定位重合,皮尔森系数为0.98。此外,25.00 mg/L的CA-71对体外HUVEC细胞24 h抑制率为(7.70±0.93)%,与等质量浓度绿原酸对HUVEC细胞的抑制率(8.24±1.18)%接近,总体呈现低毒性,但无显著性差异。

探讨脑脊液细胞学检测与病毒抗体检测在病毒性脑膜炎诊断中的临床价值

目的探讨研究脑脊液细胞学检测与病毒抗体检测在病毒性脑膜炎诊断中的临床价值。方法选取颅内感染患者92例,根据其手术最终诊断结果进行分组,50例确诊病毒性脑膜炎患者纳入观察组,42例患者确诊化脓性脑膜炎纳入对照组,均予以患者进行脑脊液细胞学检测与病毒抗体检测,分析此类检测手段在诊断病毒性脑膜炎中的应用价值。结果脑脊液细胞学检测中,观察组患者早期细胞学上以激活淋巴细胞反应为特征,活淋巴细胞数目可见显著增加,随病情发展及治疗而降低,最终回归淋巴细胞和单核细胞;病毒抗体检测中,观察组IgG阳性检出率高于对照组(P<0.05),但抗体IgM比较,两组患者阳性检出率比较无差异(P>0.05)。结论脑脊液细胞学检测与病毒抗体检测在病毒性脑膜炎诊断中具有较高可行性,是评估中枢神经系统病毒感染一项重要指标,对鉴别颅内感染类型同样有重要现实意义,对提高患者诊断结果准确性能起到很好辅助作用,值得推广。

抗体依赖细胞介导的细胞毒性抗肿瘤研究进展

近年来,随着单克隆抗体临床应用的逐渐增加,抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)的抗肿瘤效果日益受到重视。自然杀伤细胞(NK细胞)是介导ADCC特异性抗肿瘤最主要的效应细胞,而吞噬细胞、T细胞及粒细胞对ADCC抗肿瘤效应也有一定作用。ADCC被证明是单克隆抗体临床治疗肿瘤的重要机制和手段,IgG型抗体首先通过抗原结合部位与靶细胞(肿瘤细胞)结合,再由效应细胞上的FcγR识别其Fc段,介导ADCC。已投入临床应用的单克隆抗体有:利妥昔单克隆抗体及新型的抗CD20单克隆抗体、曲妥珠单克隆抗体、西妥昔单克隆抗体、依决洛单克隆抗体、尼妥珠单克隆抗体及吉妥单克隆抗体,这些单克隆抗体均具有ADCC抗肿瘤作用。单克隆抗体介导的ADCC抗肿瘤疗效受多方面因素影响,包括:IgGFc受体的基因多态、肿瘤细胞抗原、血清抗体水平、细胞因子及药物等。FcγRIIIa-158V/V基因型和FcγRIIa-131H/H基因型比其他基因型的外周血单个核细胞的ADCC作用更强。提高肿瘤抗原水平,降低血清抗体水平或增加某些细胞因子(如IL-2,IL-21,IL-15等)均可提高单克隆抗体的ADCC作用,而避免使用某些药物(如地塞米松、肿瘤坏死因子拮抗剂)或适当使用昂丹司琼和氯马斯汀也可增强单克隆抗体的ADCC抗肿瘤作用。总之,ADCC抗肿瘤的临床应用十分重要,但效果会受多方面因素的影响。本文就ADCC杀伤机理、临床常用的和已投入临床使用的具有ADCC抗肿瘤效应的单克隆抗体,影响ADCC抗肿瘤效率的因素及其他细胞ADCC的抗肿瘤作用进行了综述。

人iPSC源性肝细胞抗体药物肝毒性评价研究

目的 用人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)源性肝细胞评估抗体药物的肝细胞毒性。方法 qPCR、Western blot、细胞免疫荧光检测肝细胞特征性表型分子白蛋白、尿素氮及药物代谢酶的表达;MTT法检测肝细胞生长情况;ELISA检测肝细胞白蛋白、尿素氮分泌水平;过碘酸-雪夫染色、油红O染色检测肝细胞储存糖原、脂滴的能力。结果 HcHAb18、Hab18、5A12单抗处理后人iPSC源性肝细胞生长和分泌功能并未发生明显改变;然而,肝细胞特征性表型分子表达降低,糖原和脂滴储存能力抑制,药物代谢酶表达相应改变。结论 3株单抗虽不影响人iPSC源性肝细胞的生存,但改变其表型和代谢;人iPSC源性肝细胞可用于抗体药物的肝细胞毒性评估。

兔抗细胞周期蛋白依赖激酶6(CDK6)抗体的制备及鉴定

目的 制备兔抗重组细胞周期蛋白依赖激酶6(CDK6)抗体并进行鉴定。方法 合成并构建pET21a(+)-CDK6重组质粒,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,经SDS-PAGE及Western blot法检测蛋白表达;用镍氮川三乙酸(Ni-NTA)亲和层析柱纯化,SDS-PAGE分析;纯化后的CDK6蛋白多部位、多次(隔周)免疫日本大耳白兔,分别于免疫的0、 2、 4、 6周取血,分离血清。采用间接ELISA检测效价,Western blot法、免疫荧光细胞化学染色和免疫组织化学染色法检测其特异性。结果 表达并获得高纯度的CDK6蛋白,制备了兔抗CDK6重组蛋白抗体,其效价达1∶30 000,能特异性识别宫颈癌细胞及宫颈癌组织中表达的CDK6蛋白。结论 成功制备了高效价、特异性强的兔抗CDK6抗体。

抗小鼠宫颈癌单克隆抗体的补体依赖细胞毒性作用

采用微量细胞毒性试验研究抗小鼠宫颈癌U_(14)单克隆抗体的补体依赖细胞毒性作用。对于免疫的肿瘤U_(14)细胞,细胞毒性作用非常显著;单克隆抗体的细胞毒性作用依赖于家兔血清补体;当用豚鼠血清补体时,靶肿瘤细胞不会发生溶解。但在体内实验,单克隆抗体与补体的联合应用对于大量宫颈癌细胞的治疗无效。

1例单纯疱疹病毒性感染合并抗神经元及胶质细胞抗体阳性脑炎报道

本文报道了1例10月龄男性患儿,该患儿以“肢体无力、反复抽搐、意识不清”起病,脑脊液病原高通量检查示Ⅰ型人类疱疹病毒阳性,诊断病毒性脑炎,经抗病毒、免疫支持、防治癫痫及综合康复等治疗好转出院;起病1个月后患儿症状加重,头颅磁共振示病灶范围较前扩大,查血清抗神经元及胶质细胞抗体阳性,增加诊断自身免疫性脑炎,予激素、丙种球蛋白免疫治疗及康复治疗后好转出院,随访病情无反复,头颅磁共振示病灶范围无继续扩大。

体外研究抗CD20单克隆抗体对骨髓瘤细胞的细胞毒性作用

目的 :体外探讨上调多发性骨髓瘤 (MM)细胞表面CD2 0抗原表达后 ,抗CD2 0单克隆抗体美罗华对骨髓瘤细胞的细胞毒性作用。方法 :将浓度为 (0 - 80 0 )× 10 3 U/L的重组人干扰素γ(hrγ -IFN) ,分别与 10例初治(初治组 )和 10例复发难治 (难治组 )的MM患者瘤细胞共同培养 ,流式细胞仪测定培养前后瘤细胞表面CD2 0的表达 ;应用MTT比色法分析不同浓度美罗华对CD2 0抗原表达上调后瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用 (AD CC)和补体依赖性细胞毒作用 (CDC)。结果 :hrγ -IFN浓度分别≥ 5× 10 4U/L或≥ 1× 10 5U/L ,可明显增加初治组或难治组瘤细胞表面CD2 0的表达 ,在用 8× 10 5U/Lhrγ -IFN上调瘤细胞表面CD2 0抗原的表达后 ,12mg/L和 16mg/L的美罗华分别能显著介导初治组和难治组效应细胞对MM瘤细胞的ADCC和激活CDC。结论 :体外hrγ -IFN上调MM瘤细胞表面CD2 0的表达后、抗CD2

病毒IgM抗体及细胞学检测对病毒性脑炎的诊断价值

目的探讨病毒性脑炎的脑脊液和血清病毒IgM抗体检测对病毒性脑炎的诊断特异性和应用价值。方法78例于2007年4月～2008年6月就诊于我院,诊断为病毒性脑炎(46例)、脑膜炎(32例)的患者,于入院10d内对血和脑脊液病毒IgM抗体检测。结果78例患者血清中共检测出病毒抗体阳性48例,阳性率61.5%。以COXB和EBV为主要病原。78例患者中有52例进行了脑脊液抗体检测,阳性9例,阳性率17.3%。以HSV和EBV为主要病原。78例患者中有39例行镜下细胞学分类,淋巴细胞为主32例、单核细胞为主1例、中性粒细胞为主6例。结论用ELISA法检测病毒特异性IgM抗体是早期确定病毒性脑炎病原的较理想方法,CSF细胞学检查快速、简便,是诊断CNS病毒感染的重要指标之一。

针药结合对Graves'眼病患者血清眼外肌抗体依赖细胞介导的细胞毒作用

为探讨针药结合治疗Graves 眼病 (GO)的免疫学机理 ,5 4例GO患者随机分为治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组和对照组各 18例 ,测定治疗前后患者血清对人眼外肌抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)作用及血清抗眼肌膜抗体 (EMAb)的水平。结果 :治疗后患者血清对眼外肌的ADCC作用较治疗前明显降低 ,且治疗Ⅱ组低于对照组 (P <0 0 5 ) ;血清EMAb水平在针刺治疗后明显降低 (P<0 0 5 ,P <0 0 0 1) ;针刺Ⅱ组水平低于Ⅰ组和对照组 (P <0 0 1,P <0 0 0 1)。提示针药结合治疗Graves 眼病的眼肌损伤可能与降低EMAb ,减轻对眼外肌的ADCC有关。

人源性单克隆抗体AT_4对卵巢癌ao10/17细胞的细胞毒性作用

目的和方法：本研究应用MIT比色法分析人源性单克隆抗体（HMcAb）AT4对于人卵巢癌细胞ao10／17的体外细胞毒。结果：HMcAbAT4能激活人和家兔血清补体介导的ao10／17细胞的细胞溶解，介导人效应细胞对于靶肿瘤细胞的抗体依赖细胞毒，增强人LAK细胞对于ao10／17细胞的杀伤作用。结论：HMcAbAT4在体外可介导对于人卵巢癌细胞的抗体依赖效应细胞的细胞毒和补体依赖细胞溶解，因而可能成为卵巢癌免疫治疗研究特别有希望的试剂。

人源化基因修饰猪红细胞与人血清免疫相容性的体外研究

目的 探讨野生型(WT)、四基因修饰(TKO/hCD55)和六基因修饰(TKO/hCD55/hCD46/hTBM)猪红细胞与人血清的免疫相容性和免疫差异。方法 收集20名不同血型志愿者的血液,将WT、TKO/hCD55和TKO/hCD55/hCD46/hTBM猪红细胞、ABO-相容(ABO-C)及ABO-不相容(ABO-I)人红细胞分别暴露于不同血型人血清中,检测血凝集、抗原抗体结合(IgG、IgM)水平和补体依赖细胞毒性,评估2种基因修饰猪红细胞与人血清的免疫相容性。结果 ABO-C组未出现明显凝集;WT组和ABO-I组凝集水平高于TKO/hCD55组和TKO/hCD55/hCD46/hTBM组(均为P<0.001)。WT组猪红细胞裂解水平高于ABO-C组、TKO/hCD55组和TKO/hCD55/hCD46/hTBM组;ABO-I组猪红细胞裂解水平高于TKO/hCD55组、TKO/hCD55/hCD46/hTBM组(均为P<0.01)。TKO/hCD55组猪红细胞IgM和IgG结合水平均低于WT组和ABO-I组;TKO/hCD55/hCD46/hTBM组猪红细胞IgG和IgM结合水平低于WT组,IgG低于ABO-I组(均为P<0.05)。结论基因修饰猪红细胞的免疫相容性优于野生型猪,并接近于ABO-C,人源化猪红细胞在血资源奇缺时可考虑作为血液来源。

病毒性心肌炎时柯萨奇B组病毒抗体、T细胞亚群及红细胞免疫检测结果观察

本文对79例急性期病毒性心肌炎患儿检测COXB-IgM,其中37例检测T细胞亚群CD3、CD4、CD8、CD4/CD8,18例测红细胞免疫E-C3_b,RBC-IC,结果显示:79例心肌炎患儿中49例COXB-IgM阳性,与对照组相比有极显著性差异。心肌炎患儿CD8增高明显,CD4/CD8显著降低,T细胞亚群的改变与病毒感染有关。红细胞C3_b受体阳性率明显提高,存在细胞免疫功能异常及免疫调节功能紊乱。

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的鉴定

筛选建立了 8株牛病毒性腹泻病毒 (BVDV )单克隆抗体杂交瘤细胞 ,通过对其染色体的分析、单克隆抗体免疫球蛋白类型及病毒中和活性等指标的检测 ,表明 8株单克隆抗体杂交瘤细胞的染色体数目均接近两亲本细胞的染色体数目之和 ;单克隆抗体免疫球蛋白类型均为IgG ,其中 6株为IgG1,2株为IgG2a ,且对BVDV具有不同程度的中和能力。

应用补体依赖抗体细胞毒性试验诊断地方性牛淋巴肉瘤

利用淋巴肉瘤细胞上肿瘤相关抗原(TAA)的单克隆抗体,来评价末梢血液淋巴细胞的补体依赖抗体细胞毒性试验在诊断地方性淋巴肉瘤(EBL)上的应用。28头EBL 牛中有27头表现出细胞毒素指数(CI)超过31.7,CI 值31.7作为 EBL 阳性的最低值;其余1头牛的末稍血液淋巴细胞(PBL)和肿瘤细胞其 CI 值分别为28.0和61.0。另外,有一例被牛白血病病毒(BLV)感染而未出现淋巴肉瘤症状的牛和9头未感染 BLV的牛,其 CI 值均小于31.7。根据血相检查,TAA 阳性细胞往往是呈不典型的形态。因为 TAA 阳性细胞在 EBL 牛的外周血液里循环,使用单克隆抗体进行 PBL 的 CDAC 试验,是诊断 EBL 适用的诊断方法。另外,也可用于无白血病或临床症状不明显的 EBL 病例诊断。

抗卵巢癌细胞膜抗体对卵巢癌细胞体外细胞毒性试验及荷瘤小鼠的体内聚集性的实验研究

目的 :探讨抗卵巢癌细胞膜抗体作为放射免疫治疗载体的可能性 ,及对靶细胞体外裸鼠体内杀伤的相对特异性。方法 :采用补体介导细胞毒性试验 (MTT法 )测定抗卵巢癌细胞膜抗体对靶、非靶细胞比毒性 ;建立 BAL B/ C- m u裸鼠荷人卵巢癌模型 ,用 SPECT显像及病理检查分析 1 31 I标记抗卵巢癌细胞膜抗体在荷人卵巢癌裸鼠的聚集性。结果 :抗卵巢癌细胞膜纯化抗体比抗血清对卵巢癌靶细胞显示了更强的细胞毒作用 ,并且都显示了浓度梯度依赖性。抗卵巢癌细胞膜抗体对靶、非靶细胞比毒性显示了相对特异性 ,对卵巢癌细胞杀伤率高于非靶细胞 (宫颈癌、肝癌、胃癌、O型白细胞 )。并且呈时间依赖关系。1 31 I标记抗卵巢癌细胞膜抗体对荷人卵巢癌裸鼠腹腔注射 3d后 ,肿瘤区即有明显聚集 ,一直持续至第 8天。注射后第 8天 ,行病理检查 ,肉眼见有局部坏死淤血区 ;镜下见癌区组织大片状坏死 ,坏死区可见淋巴细胞浸润。结论 :抗卵巢癌细胞膜抗体对体内、体外卵巢癌细胞有相对特异性靶向性 。

HCV感染人滋养层细胞过程中抗体依赖性增强作用的初步研究

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)在感染人滋养层细胞的过程中是否存在抗体依赖性感染增强(ADE)作用,探讨HCV母婴传播的分子机制。方法将HCV阳性血清以4种不同方式感染体外培养人滋养层细胞,应用RT-PCR法对标本进行HCVRNA定性检测,并进一步评估不同浓度CD16单抗对感染过程的阻断作用。此外,应用免疫电镜技术观察滋养层细胞感染HCV病毒颗粒情。结果HCVRNA在全血清组、CD81单抗阻断组及LDL-R单抗阻断组多个标本均为阳性表达,且平均拷贝数较高,在FcγRⅢ(CD16)单抗阻断组多个标本内未能检测到HCVRNA的表达,且阳性标本拷贝数较低;CD16单抗对感染的阻断作用随浓度的升高而增强;在全血清组、CD81单抗阻断组及LDL-R单抗阻断组多个标本细胞内可间断测得未脱壳的HCV病毒颗粒,CD16单抗阻断组细胞内未能检出。结论滋养层细胞膜CD81和LDL-R分子不参与HCV感染滋养层细胞的过程,而FcγRⅢ分子则与此过程密切相关。HCV感染人滋养层细胞过程中存在抗体依赖性增强作用。