胃癌合并Hp感染患者Hp血清抗体基因分型测定及其意义

目的 了解本地区胃癌患者幽门螺杆菌(Hp)血清抗体基因分型情况及胃癌发生与Hp血清抗体基因分型的可能影响因素。结果 Ⅰ型幽门螺杆菌在胃癌中所占比例较Ⅱ型更高,差异有统计学意义(χ2=15.2,P<0.05);非萎缩性胃炎组Ⅰ型所占比例小于Ⅱ型,差异有统计学意义;胃癌患者幽门螺杆菌抗体基因分型I型与Ⅱ型与性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05),幽门螺杆菌抗体基因分型I型与吸烟史、饮酒史及胃癌家族史有一定相关性。结论 幽门螺杆菌抗体基因分型在胃癌及非萎缩性胃炎中有差异,其检测结果可指导并助力临床抗幽门螺杆菌精准及个体化治疗。

抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 :构建抗人HBsAg单链抗体基因 ,并分析其在COS 7细胞中的表达。方法 :以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板 ,分别扩增其轻、重链可变区 (VL、VH)基因 ,通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(Gly4Ser) 3的编码序列连接 ,并引入前导肽编码序列 ,构建具有L VH Linker VL 结构的单链抗体基因。将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白 (GFP)融合表达载体pEGFP N3,并转染COS 7细胞进行表达。结果 :经测序表明 ,前导肽、连接肽、VL 及VH 的序列正确。酶切鉴定证实 ,成功地构建了GFP基因融合表达载体。瞬时转染COS 7细胞后 ,通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达。转染细胞的培养上清浓缩后 ,进行SDS PAGE及Westernblot分析 ,可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达。培养上清的间接ELISA检测证实 ,所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性。结论 :成功地构建了抗人HBsAg单链抗体基因 ,并可在COS

优化重叠PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变

利用重叠PCR技术扩增单链抗体基因或位点突变是抗体文库构建或稳定表达的关键和难点，国内外文献未见其方法学的系统报道。以不同VH、VL和Linker基因为拼接模板进行重叠PCR，针对影响重叠PCR扩增的拼接类型，引物设计，反应条件等进行优化。结果表明两段重叠连接比三段更容易实现，且扩增效果好；引物的互补序列长度一般应大于15bp，且在18—24bp时扩增效果最好；退火温度在52—600C，Mg^2＋浓度在1．5—2．5mM时对拼接的效果影响较小；直接或间接使用拼接模板均可以实现重叠PCR的扩增。利用优化策略，首次构建了抗除虫菊酯的scFv基因文库并引入抗XAC糖蛋白scFv基因的点突变，为除虫菊酯抗体文库构建和抗XAC重组抗体的稳定表达奠定了基础。

SOE-PCR法合成狂犬病毒单链抗体基因Fv57

目的:通过一系列短引物拼接合成狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57。方法:采用SOE-PCR的方法,利用多条短的寡核苷酸引物,经过6轮PCR,拼接合成800bp左右的狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57,并利用此方法修正了上述PCR过程中产生的多处突变,从而获得正确的单链抗体基因序列。结果:采用SOE-PCR法合成的基因序列经测序及酶切鉴定,与预期结果一致。结论:成功地利用SOE-PCR法合成了狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57,为其下一步构建原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达奠定基础。

抗转铁蛋白受体鼠源性单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

目的 利用基因工程技术将鼠源性单克隆抗体WuT9改造成单链抗体。方法 从分泌抗CD71单克隆抗体的杂交瘤细胞WuT9中提取总RNA ,采用OligodT为逆转录引物 ,逆转录合成cDNA第一链 ,然后分别采用VL 和VH 框架区的PCR引物 ,扩增VH(重链可变区 )和VL(轻链可变区 )DNA片段 ,利用事先合成的存在于VL 下游引物和VH 上游引物的部分人工连接子重叠互补序列 ,将VL 和VH 的PCR回收产物进行部分重叠PCR(SOE) ,形成单链抗体基因。最后将此基因重组进表达载体pBAD gIII C中 ,经L arabinose(左旋阿拉伯糖 )诱导表达并初步鉴定。结果 构建出 70 0bp左右的单链基因 ,并获得阳性重组表达载体克隆 ,表达产物为相对分子质量 2 70 0 0左右的蛋白分子。结论 经因特网查询表明 ,单链抗体基因重链部分属于小鼠H链可变区ⅠA亚组 ;轻链属于小鼠κ轻链可变区Ⅱ亚组 ,此单链抗体基因的表达产物具有一定的特异结合活性。本研究为抗CD71单链抗体的临床应用打下了基础。

抗HBs Ag单链Fab抗体基因酵母表达载体的构建

采用重叠PCR技术 ,以抗乙肝表面抗原 (HBsAg)IgG铰链区基因为Linker将Fab抗体基因的重链和轻链连接起来 ,构成单链Fab基因。通过测序鉴定 ,克隆的单链Fab基因与理论上的完全一致 ,并成功构建含完整单链Fab基因的毕赤酵母 (P pastoris)表达载体。

抗人RBC A抗原50A株单抗可变区基因克隆及单链抗体基因构建

目的：从分子水平分析抗人红细胞血型Ａ抗原单克隆抗体５０Ａ株，进而为制备新一代基因工程抗体的血型检定试剂奠定基础。方法：从杂交瘤细胞提取总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增、克隆抗体的轻、重链可变区基因，用ＰＣＲ及双脱氧核苷酸链终止法分析其核苷酸序列，采用ＰＣＲ技术重叠延伸拼接法构建５０Ａ单抗单链抗体基因。结果：序列分析表明所克隆基因为抗体轻、重链可变区基因，５０ＡＶＨ隶属于小鼠Ｉｇ重链ⅡＢ亚组，是由ＶＨ－Ｄ－ＪＨ３基因重排产生；５０ＡＶＬ隶属于小鼠ＩｇＫａｐｐａ链Ⅱ亚组，Ｊｋ１基因重排。重叠延伸拼接法构建单链抗体基因简易可行。结论：所克隆基因含有正确的抗体框架结构，可作为研究基因工程血型检定抗体的目标基因。

人癌胚抗原单链抗体基因的构建和筛选

从分泌抗癌胚抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉａｎｔｉｇｅｎ，ＣＥＡ）单抗的杂交瘤细胞株Ｃ５０中提取总ＲＮＡ，逆转录成ｃＤＮＡ，ＰＣＲ扩增分别得到抗体轻、重链可变区基因，再利用两对ＰＣＲ引物合成和扩增得到全单链抗体基因．将含轻、重链可变区序列的ＤＮＡ片段克隆于含噬菌体基因Ⅲ的噬菌粒ｐＣＡＮＴＡＢ５．重组克隆在噬菌体表面表达基因Ⅲ与单链抗体的融合蛋白．表达具抗原结合活性的单链抗体的重组噬菌体可以通过亲和筛选的方法筛选得到并富集．利用该方法我们可以从许多分泌不同抗体的杂交瘤细胞ＲＮＡ中快速克隆和筛选功能性抗体可变区基因．

采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源抗肾癌抗体基因库

目的采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源抗肾癌抗体基因库。方法分离肾癌患者的外周血淋巴细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体全长Kappa型轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因,分别插入载体pDGB-HC-TM,电击转化感受态大肠杆菌TOPO10,构建轻、重链抗体基因库,然后将轻、重链抗体基因库联合转染293T细胞,流式细胞仪分析全长人源抗体在293T细胞表面的表达。结果成功构建IgG1-Kappa型抗肾癌抗体基因库,随机挑选的克隆经DNA序列分析显示轻、重链库的序列正确性达90%(9/10)和80%(8/10),流式细胞仪分析显示来自轻、重链库的上述克隆各有7个可检测到相应基因在293T细胞表面的表达,可表达抗体库库容量高达7.5×1010。结论 IgG1-Kappa型抗肾癌抗体基因库转染293T细胞后能够在细胞表面表达全长人源抗体,抗体的多样性为下一步筛选特异性抗体奠定良好的基础。

从肿瘤病人少量外周血淋巴细胞克隆抗体基因

建立杂交瘤单抗亲和层析纯化抗原、体外抗原致敏淋巴细胞和RT PCR克隆人抗体基因的技术 .将亲和层析纯化的大肠癌相关抗原CA Hb3经SDS PAGE和免疫印迹鉴定后 ,与IL 2和丝裂原于体外致敏大肠癌病人 1 0ml外周血淋巴细胞 (PBL) ,出现淋巴母细胞化和集落形成现象 .致敏PBL的总RNA比未致敏PBL的量增加了 2 5倍 .致敏后RT PCR扩增的人抗体VH CH1 (IgG)和VL CL(κ)基因的量比未致敏者多 1 3倍 .该技术可将鼠源杂交瘤单抗人源化 .

PCR扩增人外周血淋巴细胞抗体基因的探讨

采用ＲＴ－ＰＣＲ法，以一组人抗体重链和轻链简并引物，直接从人外周血混合淋巴细胞中扩增出抗体重链Ｆｄ和κ轻链基因．结果提示：用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取细胞总ＲＮＡ，以Ｏｌｉｇ（ｄＴ）引导合成ｃＤＮＡ第一链，再经ＰＣＲ扩增的方法，是值得优先采用的方法．细胞总ＲＮＡ的提取不必追求高纯度，少量外周血即足以满足构建抗体库所需，简并引物可获得良好的扩增效果。

入侵检测免疫模型中抗体基因库的生成和进化

文中简要分析了当前入侵检测技术存在的问题和发展方向,结合人体免疫理论,提出一种基于检测代理的分布式网络入侵检测免疫模型。为了提高免疫系统识别异常的轻负荷和适应性,引入粗集理论的约简算法,用于待检数据的预处理和抗体基因库的生成,并结合抗体进化原理不断对基因实施进化。该模型可降低待检数据的冗余,保持抗体基因的进化和适应性,提高入侵检测的效率和准确性。

抗ICAM-1单链抗体基因的克隆及序列分析

应用 RT- PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗 ICAM- 1单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞 F12中 ,扩增出抗体VH和 VL 基因 ,用 linker(Gly4 Ser) 3基因 ,将 VH和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆到 p MD18- T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 74 4 bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排鼠抗体可变区基因特征。 VH和 VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 (B)和轻链к

重症肌无力单链抗体基因的制备

[目的 ]构建抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体 .[方法 ]应用多聚酶链反应从抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区抗原结合片段扩增重链和轻链可变区基因 ,并克隆到载体噬粒 pHEN2 .将含有单链抗体基因的重组噬粒转化大肠杆菌DH5α ,分离提纯重组噬粒后再经酶切、琼脂糖凝胶电泳检查以确认单链抗体基因的正确性 .[结果 ]电泳检查发现了大小分别为 3 78bp ,3 3 9bp和 762bp的重链可变区、轻链可变区和单链抗体基因 ,且位置正确 .[结论

鼠抗人转铁蛋白单链抗体基因的表达

目的 制备抗人转铁蛋白单链抗体。方法 拼装好并带有酶切位点粘性末端的鼠抗人转铁蛋白的单链抗体基因经凝胶电泳定量后,同载体pCANTAB 5E连接,以其转化E.coli TG1细胞,经辅助噬菌体M13K07挽救构建噬菌体抗体表面呈现文库、抗原包被固相材料富集选择阳性重组噬菌体克隆（Panning）。感染能产生可溶抗体片段的大肠杆菌菌株E.coli HB2151,制备可溶抗体,以Anti-E末端抗体进行Western blot、ELISA检验和分子量测定。结果 人转铁蛋白的单链抗体基因成功表达。结论 用基因工程抗体技术制备抗体是可行的。

抗HBsAg鼠/人嵌合抗体基因的构建、表达及鉴定

用抗体工程法构建抗乙肝表面抗原(HBsAg)鼠/人嵌合抗体的嵌合基因,并在哺乳动物细胞中成功地表达。分离鼠McAb 2H1(抗HBsAg)轻、重链可变区基因,并连接到含有人轻链(Kappa)及重链(Gamma 1)恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中;用电穿孔法将嵌合基因导入小鼠SP2/0细胞,得到高效表达。2H1嵌合抗体能特异性地与HBsAg结合,并能有效地与亲代McAb竞争;与血源性多克隆乙肝免疫球蛋白(HBIG)比较,其具有特异性好、节约血源、价廉、质纯、无其他病毒,如HIV等污染制品的可能等优点,可用于阻断乙肝母婴传播及在意外感染时被动免疫。

抗体基因芯片应用于检测鼻咽癌组织切片蛋白质表达谱的研究

目的研究应用抗体基因芯片检测鼻咽癌组织特异性蛋白质表达谱的新技术方案。方法利用噬菌体抗体库筛选出抗鼻咽癌的特异性抗体库,以扩增抗体基因V-D-J片段作为标识分子用于制备抗体基因芯片;通过特异性抗体库与鼻咽癌肿瘤组织结合后,使标记引物扩增的V-D-J序列与抗体基因芯片进行杂交后显示癌组织的蛋白质表达谱,从而选择性通过免疫组织化学显示其中关键性蛋白质原位表达状况。结果肿瘤组织结合的抗体滴度可达到106～108数量级,标记的DNA分子效价约为10-6～10-8,以该文一次检测20个抗体为例,基因芯片检出有10～14个阳性蛋白质表达谱;免疫组织化学可显示阳性抗体在细胞中的结合部位。结论以抗体基因芯片为核心的技术方案,能在组织切片上同时检测含多个蛋白质表达谱,可以广泛应用于基础研究和临床诊疗过程。

应用PCR从丙型肝炎患者外周血B淋巴细胞扩增抗体基因

用常规RT PCR法 ,以 1组人抗体重链和轻链简并引物 ,直接从 5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增出抗体重链Fd基因和κ轻链基因。结果提示 ,用Trizol试剂提取细胞总RNA ,以Olig(dT)引导合成cDNA第一链 ,再经PCR扩增的方法 ,是值得优先采用的方法。细胞总RNA的提取不必追求高纯度 ,少量外周血即足以满足构建抗体库所需 ,简并引物可获得良好的扩增效果 。

抗人红细胞单链抗体基因的构建及表达

从分泌抗人红细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞 3F5中提取总 RNA,逆转录成 c DNA,用合成的寡核苷酸引物通过 PCR扩增和克隆单抗的轻、重链可变区基因 ,用双脱氧核苷酸链终止法分析核苷酸序列 ,采用 PCR拼接法构建单链抗体基因 ,并插入原核表达载体 PEt- 2 8a,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经 IPTG诱导后表达 .序列分析表明所克隆的 VL、VH分别属于鼠 Ig Kappa轻链 IV亚组和 Ig重链 亚组 .VH、VL基因均含正确的框架结构 ,构建的单链抗体基因全长 750 bp,在原核系统中的表达产物经 SDS- PAGE分析相对分子量约为 2 80 0 0 .

抗人VEGF单链抗体基因的克隆及突变校正

目的:回复基因克隆过程中的异常点突变,重新表达抗人血管内皮生长因子(VEGF)单链抗体基因(V11),恢复其抗原结合能力。方法:通过逆转录及多聚酶链式反应(RT-PCR),扩增抗人VEGF单克隆抗体(E11)的可变区基因片段,构建表达载体pET-15b(含E-tag)。将V11轻、重链可变区基因序列(V11L、V11H)与其所属亚组共同序列和一致序列进行联配比较,发现异常氨基酸并分析其性质,确定异常突变点。PCR定点回复突变,重新表达单链抗体基因(V11m),ELISA检测表达产物与VEGF165的结合。结果:V11存在四个异常突变点:V11L第7、23、36位,V11H第113位。回复突变后的表达产物与VEGF165的结合能力显著提高。结论:利用抗体残基位置序列保守性及氨基酸侧链性质分析,可以推定并有助于回复异常点突变,该方法简便易行。获得的抗人VEGF单链抗体对恶性肿瘤的诊治具有潜在的应用价值。