鸡新城疫抗体消长规律及血清抗体稳定性

为研究鸡新城疫灭活疫苗免疫后抗体消长规律及血清抗体稳定性,采用血凝抑制试验方法测定新城疫病毒-禽流感病毒(H9亚型)二联灭活疫苗免疫鸡血清新城疫抗体效价及经室温、4℃、-20℃、-80℃反复冻融和加热等不同方式处理的血清中新城疫抗体效价。结果表明,试验鸡于1日龄和21日龄用灭活疫苗免疫两次后,在第二次免疫后14 d新城疫抗体平均效价达到8.1 log_(2),35 d达到最高值为8.9 log_(2);免疫后70 d抗体效价保持在7.8 log_(2),且自二免后14~70 d,新城疫抗体效价维持在7.8 log_(2)~8.9 log_(2)。血清新城疫抗体在室温和4℃相对稳定,室温下放置13 d对新城疫抗体效价几乎无影响;但4℃保存9 d,对新城疫抗体效价有一定影响,且差异显著(P<0.05);56℃下30 min对新城疫抗体效价无影响;反复冻融3次对新城疫抗体效价影响极显著(P<0.01)。肉鸡于1日龄和21日龄用灭活疫苗免疫两次后,新城疫抗体水平高,且高水平抗体维持时间长。鸡血清新城疫抗体可耐56℃加热,室温保存活性稳定,反复冻融则影响其效价。

加热灭活及4 ℃储存对血浆新型冠状病毒总抗体稳定性影响的研究

目的探讨严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染患者的血液标本经不同灭活和储存处理后,SARS-CoV-2总抗体稳定性的变化,从而论证以56℃,60 min加热作为患者血液标本安全有效的灭活方法的可行性。方法选取2020年2月24日至2020年3月30日深圳市第三人民医院收治的47例2019新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)确诊患者,另外选取同期因其他疾病入院的已排除患有COVID-19可能的33例住院患者。抽取两组研究对象的肘静脉乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝血液,应用化学发光微粒子免疫检测法检测56℃,30 min灭活前后和60 min灭活前后血浆SARS-CoV-2总抗体水平,并在指定时间点检测SARS-CoV-2总抗体,进一步比较不同灭活处理方式及不同储存时间对SARS-CoV-2总抗体的影响。结果56℃,30 min灭活前后和60 min灭活前后,血浆样本中SARS-CoV-2总抗体检测阳性结果一致率分别为96.15%和100%,灭活前后总抗体样本临界指数(cut-off index,COI)值的Pearson相关系数分别为0.9965(95%CI:0.9920~0.9984,P<0.05)和0.9981(95%CI:0.9962~0.9990,P<0.05)。血浆样本经先离心再灭活处理与先灭活再离心处理,SARS-CoV-2总抗体阳性结果一致率为100%,两组总抗体COI值的Pearson相关系数为0.9995(95%CI:0.9950~0.9999,P<0.05)。未灭活样本4℃储存30 d;56℃,30 min或60 min灭活样本4℃储存10 d,SARS-CoV-2总抗体COI值均未出现显著性变化。结论56℃,30 min或60 min灭活处理血浆样本及灭活后4℃储存10 d,未灭活4℃储存30 d均不会对SARS-CoV-2总抗体的检测结果造成影响。

人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体的生物学特性研究

对抗狂犬病毒scFv进行稳定性改构 ,纯化制备有活性的人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体片段 (dsFv) ,然后对其生物学活性进行研究。将dsFvVH 、VL 基因在原核表达系统pET2 2b(+) BL2 1(DE3)中表达 ,将其包涵体分别在变性缓冲液中溶解 ,稀释后加入折叠缓冲液使其折叠形成有活性的dsFv抗体片段 ,上Ni NTA柱进行纯化。然后以其亲本scFv作为对照 ,对dsFv的亲和力、稳定性以及体外中和活性进行评价。结果显示 ,与其母本抗体scFv相比 ,改构后的抗狂犬病毒dsFv保持了对狂犬病毒Vero疫苗的特异性识别能力 ,而且其亲和力明显提高 ;抗狂犬病毒dsFv在血清和BSA中的稳定性有明显的改进 ,而且其热稳定性和抵抗尿素化学变性的能力亦大大改进 ;蚀斑减少中和实验显示 ,抗狂犬病毒dsFv抗体片段能特异中和狂犬病毒 ,阻止狂犬病毒对Vero细胞的吸附 ,抑制狂犬病毒对靶细胞的感染 ,从而导致蚀斑减少甚至消失 ;scFv抗体片段仅可部分抑制蚀斑的形成 ,但不能全部抑制。这为进一步研究抗狂犬病毒dsFv基因工程抗体的免疫保护作用及其在临床的应用奠定了基础。

人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体片段基因的构建与表达

目的构建人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv(dsFv)抗体基因,并在原核系统中实现高效表达,制备有活性的人源抗狂犬病毒dsFv抗体片段。方法采用PCR定点突变的方法,构建抗狂犬病毒dsFv抗体的重、轻链(VH、VL)突变基因,NdeⅠ和NotⅠ双酶切后分别插入pET-22b(+)表达质粒中,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。将VL、VH包涵体蛋白经盐酸胍变性,按比例混合在复性折叠缓冲液中,使二者折叠形成dsFv抗体片段。并以其母本抗体scFv作对照,对其抗原特异性和稳定性进行初步评价。结果在VH的第44位氨基酸和VL的第100位氨基酸引入了半胱氨酸,成功构建了抗狂犬病毒dsFv抗体基因,并在原核系统中实现了对二者的高效表达,VH、VL蛋白在复性缓冲液中正确折叠形成了dsFv抗体片段。结论对筛选获得的抗狂犬病毒scFv成功进行了稳定性改构,制备了有活性的dsFv抗体片段,改构以后的dsFv保持了对狂犬病毒的特异结合活性,而其在血清中的稳定性有明显改进,而且其热稳定性和抵抗尿素化学变性的能力亦大大改进。

抗人氨基末端脂多糖结合蛋白二硫键稳定性Fv抗体的制备及生物学活性的初步研究

目的制备抗人氨基末端脂多糖结合蛋白(N-terminal fragment of human lipopolysaccharide binding protein,NH-LBP)的二硫键稳定性Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragment,dsFv),并初步测定其生物学活性。方法将含有dsFv-VL与dsFvVH包涵体蛋白经复性、折叠和纯化,获得完整的dsFv抗体。通过ELISA、TNF-α分泌等方法,初步测定dsFv抗体在体内外的生物学活性。结果获得dsFv抗体蛋白约2.1mg,dsFv与NH-LBP有较好的结合能力,并在动物体内减轻了LPS所诱导的炎症反应,发挥了一定的保护活性。结论通过分别表达VL和VH片段,再制备dsFv抗体是可行的,dsFv能部分抑制LBP的生物学功能。

人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素重组质粒的构建与表达

目的构建抗体靶向干扰素的重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+,并在真核细胞中验证重组质粒的表达情况。方法通过重叠延伸PCR将dsFv抗体重链基因与带正电荷的DNA负载区基因融合,并在抗体轻链α干扰素融合基因3′端连入6×His标签。先在过渡载体pCI-GPI中实现轻、重链复合基因的连接,然后连入pEE14.1中,最终构建重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+。将重组质粒LipofectamineTM2000瞬时转染到CHO-K1细胞,采用RT-PCR、ELISA和Western blotting方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定和测序验证与设计完全一致。RT-PCR结果显示只有重组质粒转染后的细胞能够扩增出1700bp的目的条带,ELISA检测瞬时转染细胞上清α干扰素的浓度约为1.1ng/ml,Western blotting检测显示重组质粒在转染细胞上清中获得表达。结论实现了抗体靶向干扰素在单一质粒中的高效表达,通过对表达蛋白的电性改造有利于后期治疗慢性乙肝的抗体靶向纳米粒药物的研制。

抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段抗体dsFv V_L链的构建、表达和鉴定

目的将抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)抗体的Fv L链引入半胱氨酸(Cys),并表达、纯化。方法应用mega-primer PCR方法,在抗NH-LBP单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区中引入编码Cys的基因序列,将目的序列放入载体pET-28a(+),于工程菌BL21star(DE3)中表达及TALON柱芯亲合纯化,通过ELISA法初步鉴定其与NH-LBP的结合力。结果dsFv VL链的Thr21替换为Cys,扩增出基因片段长约为650bp,经BL21star(DE3)菌表达出相对分子质量约为28×103的目的蛋白,与NH-LBP具有一定的结合力。结论抗体轻链中成功引入了Cys。

一种基于结构稳定性的抗体人源化设计流程

本研究开发了基于结构稳定性的抗体人源化设计流程,进一步提高了抗体人源化设计的效率,减小了抗体药物引起的免疫原性。使用CDR移植方法,排除了移植导致的抗体VH和VL链内和链间结合能过高的结构模板。使用人源化框架筛选方法排除了不同人源抗体VH和VL组合方式导致的抗体VH和VL链内和链间结合能过高的组合类型。通过使用VH和VL的链内和链间结合能筛选出的人源化抗体VH和VL组合类型,能有效预测实验结果。结果表明,基于VH和VL的链内和链间结合能的抗体人源化方法可以辅助人源化抗体的筛选。

抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin的表达及活性分析

结合生物信息学方法与已知癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)特异性单链抗体(Single chainFv fragment,scFv)核苷酸序列,经分子设计和密码子优化后,通过化学方法合成CEA二硫键稳定性单链抗体(Disulfide stabilized single chain Fv fragments,scdsFv)基因片段.将凋亡素基因(Apoptin)通过一段柔性连接肽(Linker)连接在CEA scdsFv基因下游,并克隆入大肠杆菌表达载体质粒pET28a,转化BL21感受态菌后经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导,表达融合蛋白CAtin.SDS-PAGE和Western-Blot分析表明,目的蛋白得到良好表达,经条件优化后表达量最高可达44.1 mg/L.融合蛋白经分步洗涤法和谷胱甘肽对表达的目的蛋白进行初步纯化和复性后,利用人肝癌细胞(HCC)对所制备融合蛋白进行亲和力测定、细胞结合活性测定和特异性细胞杀伤活性分析.结果显示,所制备融合蛋白不仅能够有效地与上述肿瘤细胞结合,并对其具有明显的杀伤活性,表明成功制备了具有特异性识别和特异性杀伤活性的双特异抗肿瘤免疫导向制剂.

基于免疫球蛋白G降解酶切和高效液相色谱的抗体电荷异构体分析技术

目的:探索和优化单克隆抗体电荷异构体分析的酶切预处理和高效液相色谱检测方法。方法:采用和优化基于Thermo ProPac^(TM) WCX-10色谱柱的离子交换色谱检测方法,以含10 mmol·L^(-1)磷酸盐和1 mol·L^(-1)氯化钠缓冲液(pH 6.3)为流动相进行梯度洗脱,流速0.5 mL·min^(-1),检测信号为波长280 nm吸收度,采用免疫球蛋白G降解酶(IdeS)切前后的电荷异构体检测,并对方法的专属性、线性、重复性、精密度等指标进行考察。结果:基于阳离子交换色谱(CEX)方法和酶切处理,以几种商品化抗体为例,展示该方法的应用,对完整的IgGs与IdeS酶切产生的F(ab’)_(2)和Fc区域进行比较分析提供更详细和更特异的电荷异构体信息。通过方法学验证,空白溶剂无干扰峰出现,进样量在10~80μg范围内,进样量与峰面积的线性关系良好(R^(2)=1.000);6次进样测得的峰面积RSD为0.52%;日间精密度3.3%;耐用性良好;在24 h内样本基本稳定,测得的峰面积RSD为3.5%;3批样品检测结果的峰面积RSD为2.5%。结论:该方法可用于全流程的抗体药物研发,包括早期阶段的分子筛选,中期产业化的工艺开发,直至产品上市质量标准和稳定性研究。