悬浮驯化CHO细胞并用于抗前列腺特异性膜抗原的抗体表达

目的将贴壁状态的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞驯化成用无血清培养基培养的悬浮CHO细胞(CHO-S),并验证用该悬浮细胞进行抗体表达的可行性。方法将贴壁状态的CHO-S细胞调整为悬浮培养后,再用逐步降低血清含量的方法将其驯化成用无血清培养基悬浮培养的CHO-S细胞。根据从噬菌体抗体库筛选获得的抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单链抗体的基因序列,人工设计并合成其重链和轻链基因,分别克隆入真核表达载体pc DNA3.1中,所得载体命名为pc DNA3.1-HC和pc DNA3.1-LC。将构建好的2个载体按照轻、重链比例为3∶1的量用Free Style MAX转染试剂瞬时转染CHO-S细胞,转染7 d后收集培养上清,用SDS-PAGE和Western blot法检测抗体表达情况,用流式细胞术检测其与PSMA阳性细胞的结合活性。结果成功将贴壁CHO细胞驯化成悬浮CHO-S细胞,成功构建了表达抗PSMA人源性抗体重链和轻链基因的真核表达载体,并在CHO-S细胞中实现了抗体的分泌表达,流式细胞术检测证实其可特异性结合PSMA阳性前列腺癌细胞。结论成功驯化获得悬浮CHO-S细胞,驯化后的CHO-S细胞可用于抗体的真核表达,为后续抗体的大量表达纯化及功能研究提供了工具。

不同组织来源腺癌细胞的形态学特征及抗体表达规律分析

目的探讨液基细胞学中不同组织来源腺癌细胞的形态学特征及抗体表达规律。方法收集2015年4月至2016年7月本院经组织学确诊为腺癌的浆膜腔积液标本90例,其中肺腺癌45例,卵巢腺癌45例,采用液基细胞学进行检测,观察不同组织来源腺癌细胞的形态学特征及糖链抗原125(CA125)、糖链抗原199(CA199)和癌胚抗原(CEA)的表达情况。结果卵巢腺癌细胞主要以集群形式(数十至数百个)排列成圆形、椭圆形、乳头状,且常有重叠,边缘较光滑,细胞排列紧密,核浆比较高,胞浆相对较少,核仁小至中等大或明显,背景中可见砂砾体。肺腺癌细胞排列成球团状,胞浆丰富,黏液分泌旺盛,使细胞团极具立体感,核大,核仁明显。肺腺癌CA125与CA199的阳性表达率分别为33.33%(15/45)和28.89%(13/45),均低于卵巢腺癌的71.11%(32/45)和51.11%(23/45);Ⅰ~Ⅱ期肺腺癌及卵巢腺癌的CA125、CA199及CEA阳性表达率均低于Ⅲ~Ⅳ期,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论不同组织来源腺癌细胞的形态学特征存在一定差异,且CA125、CA199及CEA的差异表达对于腺癌细胞来源的判断有一定价值。

冠心病患者血浆中抗热休克蛋白70抗体表达水平的研究

[目的 ]检测冠心病患者血浆中抗热休克蛋白 70 (HSP70 )抗体水平与正常人有无差异 ,并探讨其与冠心病发生发展之间的关系。 [方法 ]采用Western ELISA方法检测 192例冠心病患者中抗HSP70抗体水平 ,并以 192例无冠心病的个体作为对照。[结果 ] 192例冠心病患者中抗HSP70抗体阳性 7例 ,对照组 5例 ,病例组抗体阳性率与对照组之间差异无显著性 (P >0 .0 5 )。 [结论 ]本研究未发现抗HSP70抗体与冠心病的发生发展有联系 ,抗HSP70抗体在冠心病发病过程中的作用有待于进一步探讨。

单链抗体表达研究进展

单链抗体（single-chain antibody fragment．scFv）由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽（1inker）连接而成。在目标特定的scFv上连接放射性核素、生物毒素、药物，将极大增强对靶细胞的杀伤能力。Kanter等研究发现将个体基因型scFv和细胞因子粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子或免疫刺激肽组成融合蛋白，是一种有效治疗淋巴瘤的疫苗。Wang等通过抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和抗单端孢霉毒素（ZEN）seFv基因融合，表达为抗DON和抗ZEN scFv，结果显示双功能抗体成功构建．并可应用于DON和ZEN检测。

荨麻疹性血管炎自身抗体表达及发病机理研究

目的为了探讨荨麻疹性血管炎自身抗体表达的临床意义及发病机理。方法对16例荨麻疹性血管炎临床及实验检查资料进行分析。结果本病符合Ⅲ型变态反应引起的免疫复合物疾病,IgG和补体C3在发病和皮损形成中起了重要作用,局部组织低垂或受压至组织液体静压增大与皮损的形成亦有密切的关系。结论本病好发于成年女性,皮损以风团和环状红斑样损害为特征,四肢关节游走性疼痛和眼结膜充血为常见的表现;本病与SLE存在一定相关性,部分病例经过一个较长时期的发展后,显示了持续较高滴度的ds-DNA抗体表达。

各期梅毒患者治疗前IgG、IgA和IgM抗体表达差异的研究

目的:分析梅毒各个时期治疗前IgG、IgA和IgM抗体的表达差异。方法:采用免疫印迹法检测已确诊的34份不同时期(一期8例,二期15例,三期11例)梅毒患者治疗前血清中IgG、IgA和IgM Tp蛋白表达情况。结果:IgG抗体Tp47、Tp45、Tp34和Tp15在治疗前各期梅毒患者血清中均100%表达,Tp33在三期梅毒中的阳性率(63.6%)明显低于一、二期梅毒(均为100%),差异有统计学意义(P=0.009)。IgA抗体各期表达无明显差异,其中一期梅毒中Tp41、Tp34、Tp33和Tp30抗体以及三期梅毒中Tp33均无阳性条带出现。IgM抗体Tp41和Tp37在各期梅毒患者血清中阳性率差异有统计学意义(P值分别为0.035、0.020),其余差异均无统计学意义。结论:强阳性的Tp蛋白Tp47、Tp45和Tp15可作为早期梅毒诊断的指标;在各期表达有明显差异的Tp41、Tp37和Tp33可考虑作为临床分期观察指标;Tp45、Tp41、Tp17和Tp15可作为以后临床治疗效果的辅助诊断参考。

放射性粒子植入对转移性胸腺瘤伴重症肌无力患者相关抗体表达及淋巴细胞亚群变化的影响

目的研究放射性粒子植入治疗对转移性胸腺瘤伴重症肌无力(MG)患者抗体表达及淋巴细胞亚群变化。方法抽取2017年10月至2018年12月收治的转移性胸腺瘤伴MG患者共120例,将其遵照随机抽样法分成对照组[60例,施行三维适形调强放疗(3DIMRT)方式]和观察组(60例,施行放射性粒子植入治疗方式),研究比对患者的总缓解率、不良反应,以及不同治疗节点的肿瘤病灶大小、抗体表达情况与T淋巴细胞亚群变化等。结果观察组总缓解率(81.67%)明显高于对照组总缓解率(53.33%),差异有统计学意义(P<0.05)。治疗60 d、90 d后,观察组AChR-Ab指标均明显低于对照组(P<0.05)。治疗60 d、90 d后,观察组CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)与CD_(4)^(+)指标均明显低于对照组,而CD_(8)^(+)指标明显高于对照组(P<0.05)。治疗60 d、90 d后,观察组肿瘤病灶直径均明显小于对照组(P<0.05)。观察组不良反应发生率(8.33%)明显低于对照组不良反应发生率(21.67%),差异有统计学意义(P<0.05)。结论放射性粒子植入治疗对于缓解病情,提高临床疗效,改善抗体表达等有重要意义。

类风湿性关节炎中自身抗体表达情况及联合检测的诊断价值

探究类风湿性关节炎中自身抗体表达情况及联合检测诊断价值。方法 选取2020.5~2022.4类风湿性关节炎患者42例为观察组,另选取非RA的其他免疫性疾病42例为对照组,开展自身抗体检测,对比检测结果。结果 抗nRNP/Sm、抗Sm、抗SS-A、抗Ro-52、抗组蛋白、抗核糖P蛋白抗体、RF、抗CCP联合检测阳性率为78.57%、45.24%、47.62%、45.24%、42.86%、42.86%、73.81%、92.86%,高于对照组4.76%、7.16%、9.52%、7.14%、4.76%、4.76%、19.05%、9.52%,P<0.05;联合检测灵敏度、准确度显著高于单独抗体检测,P<0.05。结论 自身抗体和RF对诊断RA有一定临床意义,联合检测可提高患者诊断结果准确性,应用有较高诊断价值。

抗人红细胞血型A抗原单链抗体原核表达及活性测定

目的构建并表达抗人红细胞血型A抗原单链小分子抗体(single-chainFv)蛋白。方法设计合成抗重、轻链可变区引物,通过重叠延伸拼接PCR技术,在50AmAbV和VL基因间引入连结短肽,体外构建50AScFv基因并进行序列分析;将其克隆入表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中诱导表达;并以免疫印迹测定重组蛋白的生物学活性。结果序列分析表明,50AScFv基因全长747bp,编码249个氨基酸;重组体表达产物聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,融合蛋白的相对分子质量(Mr)为29000左右,与预期的结果一致,表达产物主要以不溶性包涵体形式存在;光密度扫描结果表明,重组蛋白占菌体总蛋白的16.2%,免疫印迹试验显示,重组小分子抗体保留了亲本mAb的特异性和力。结论成功地构建50AScFv基因,并在原核细胞中获得较高水平的表达,为进一步研制基因工程血型检定抗体奠定了基础。

腺相关病毒介导Smac和DR5单链抗体表达对抑制肿瘤细胞生长的作用

肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（tumor necrosis factor—related apoptosis—inducing ligand，TRAIL）是肿瘤坏死因子（TNF）家族成员，可有效地抑制多种肿瘤的形成和生长，诱导肿瘤细胞凋亡，但对绝大多数正常细胞无毒副作用。除了TRAIL配体以外，死亡受体的抗体也和TRAIL一样，能特异性地杀伤肿瘤细胞，其对肿瘤细胞的靶向性比TRAIL更有优越性，具有良好的临床应用前景。

慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病患者血清及脑脊液NF155抗体表达意义

慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病（chronic inflammatory demyelinating polyradicul oneuropathy，CIDP）为一类免疫介导的炎性周围神经疾病，其病因和发病机制目前尚不完全清楚。神经束蛋白（Neurofascin，NF）是神经细胞黏附分子LI家族的成员，在维持郎飞结的结构中发挥重要作用。

抗骨形成蛋白单链抗体的构建与表达

目的：构建抗骨形成蛋白单链抗体并获得表达。方法：应用一段人工合成的含１５个氨基酸的连接肽，采取亚克隆技术，将一株鼠抗ＢＭＰ单克隆抗体的重链可变区（ＶＨ）的Ｎ端和轻链可变区（ＶＬ）的Ｃ端连接起来；将连接产物克隆入融合蛋白表达载体ｐＥＧＸ－４Ｔ－ｌ，在大肠杆菌ＪＭ１０９中进行表达。结果：构建的单链抗体（ＳｃＦｖ）全长７０５ｂｐ，并获得融合表达产物约５２×１０３ｕ。结论：亚克隆方法是一种构建单链抗体快速、简便、可靠的方法。

抗人肺腺癌单抗5F-11噬菌体抗体库的构建及表达

目的 构建抗人肺癌单抗 5F 11的噬菌体显示文库。方法 利用RT PCR方法从 5F 11杂交瘤细胞扩增抗体轻重链可变区基因 ,用连接子连接成为ScFv基因后克隆至噬菌体载体pCANTAB5E。以肺腺癌细胞系A2 为抗原进行 4轮筛选 ,得到富集的次级噬菌体表达文库。结果 制备了库容为 8× 10 7pfu/ml的噬菌体展示文库。随机抽取未经筛选的克隆进行酶切 ,酶切图谱呈多样性 ,富集后的酶切图谱则显示特异构型的噬菌体得到富集。检测 30个噬菌体克隆上清 ,其中 2 3个与A2 细胞有较强反应。结论 本研究获得了抗人肺腺癌单抗 5F 11的单链抗体 ,为拓展抗体的应用创造了条件。

人源抗狂犬病毒中和性全抗体在昆虫细胞中的表达

将来源于噬菌体抗体库的人源狂犬病毒糖蛋白特异性单抗G10Fab的基因 ,克隆入杆状病毒人源IgG抗体表达载体 ,通过转染将重组质粒导入昆虫细胞 ,以全抗体的形式表达了一株人源抗狂犬病毒基因工程抗体G10。用亲和层析的方法纯化了表达产物 ,经与一株鼠源糖蛋白特异性单抗竞争证实 ,该单克隆抗体特异性识别狂犬病毒糖蛋白 ,亲和力约为 10 -9M。体外中和实验证明 。

高通量表达系统在EV71单链抗体表达中的应用

目的 建立从PCR产物直接表达ScFv抗体的方法,将该方法用于噬菌体抗体库淘选后ScFv抗体的高通量表达。方法 PCR扩增CMV启动子、ScFv和BGH Poly A尾基因片段,使用重叠PCR(overlapping PCR)将上述3个片段依次连接成1个线性的抗体表达盒。瞬时转染293T细胞,并用Western blot、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和间接免疫荧光抗体试验(indirect immunofluorescent antibody,IFA)检测抗体表达盒中ScFv的表达和抗体的活性。从噬菌体库淘选出的阳性克隆中挑取96个抗体,用该表达盒进行高通量表达,并对表达效果进行评价。结果 成功扩增出3个基因片段,并将3个片段连接成1个线性的表达盒。线性表达盒可直接在293T细胞中瞬时表达,表达上清经Western blot检测可见约相对分子质量为38×103的条带;ELISA和IFA结果均显示表达出来的ScFv抗体能与其对应的抗原特异性结合。同时该系统可以用于噬菌体抗体库中抗体基因的高通量表达。结论 成功构建了ScFv的线型表达盒,并实现了抗体的快速高通量表达。

抗转铁蛋白受体单链抗体的表达、纯化及活性测定

根据转铁蛋白受体和转铁蛋白特异性结合的性质,利用亲和纯化的方法从胎盘中提取转铁蛋白受体。以转铁蛋白受体为抗原包被免疫管,从全合成人源噬菌体单链抗体库中筛选其抗体。对筛选到的抗体进行特异性鉴定后,将抗体基因插入表达载体pET22b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后获得可溶性表达。HeLa细胞的免疫组化结果显示,表达的抗体可以与转铁蛋白受体结合。表达产物经Ni-NTA金属螯和层析柱纯化、脱咪唑后,从尾静脉注射小鼠。1h后,去除血液及毛细血管的干扰,在脑实质中检测到了抗体的存在,说明该抗体可以通过血脑屏障。

基于抗原-抗体共表达的细菌展示技术的优化

目的建立细菌周质内抗原抗体共表达系统。方法将人白介素-1β(hIL-1β)基因和抗人白介素1β单链抗体(anti-hIL-1βscFv)基因分别插入到细菌展示载体pBFD的pelB前导肽(游离型前导肽)和NlpA前导肽(锚定型前导肽)下游构建出重组载体pBFD-Ab-Ag。将pBFD-Ab-Ag转入到E.coli DH5α中诱导表达,抗原和抗体蛋白相互结合而被锚定到细菌内膜外侧,破除细菌外壁(原生质球制备)后与适当浓度的FITC标记的小鼠抗hIL-1β抗体进行孵育,最后经流式细胞仪检测荧光信号,根据荧光信号强弱分析抗原抗体表达和相互作用情况。结果 pBFD-Ab-Ag E.coli DH5α具有很强的荧光信号,阳性率获得了大大的提高。结论成功建立了建立细菌周质内抗原抗体共表达系统,实现了抗体和抗原细菌周质内的正确折叠和相互识别。简化了现有的抗体筛选的流程,为蛋白质相互作用的研究提供了新的技术手段。