抗Ig融合蛋白Fc段单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

目的 :制备并鉴定抗Ig融合蛋白Fc段的单克隆抗体 (mAb) ,建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法和纯化Fc融合蛋白的亲和层析法。方法 :以hBCMA Ig融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠 ,通过细胞融合制备抗Fc段mAb ,用ELISA等方法鉴定mAb的Ig亚类、表位以及种属特异性 ,建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法 ;Westernblot检测mAb对变性Ig融合蛋白的反应性。将mAb与Sepharose4B交联 ,制备亲和层析柱 ,对LAIR1 Ig融合蛋白进行纯化。 结果 :获得 7株稳定分泌抗Fc段mAb的杂交瘤 (FMUFc1～FMUFc7)。利用FMUFc4作为包被mAb ,FMUFc5作为酶标记mAb ,成功地建立了检测Ig融合蛋白的ELISA法 ,敏感度达到 2 μg/L ;在 7株mAb中 ,FMUFc6可用于Ig融合蛋白的Westernblot检测。用FMUFc6mAb制备的亲和层析柱 ,可有效地纯化LAIR1 Ig融合蛋白。结论 :成功地制备了抗Ig融合蛋白Fc段的mAb ,建立了可用于Ig融合蛋白检测和纯化的方法 。

人源乙型肝炎病毒表面抗原抗体Fab片段与IFN-α融合蛋白表达载体的筛选

目的探讨如何在无药物抗性改变；无转化细胞生物指示系统改变的情况下准确快速地筛选出人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体Ｆａｂ片段／ＩＦＮ－α融合蛋白原核表达载体。方法在 ＩＦＮ－α基因两端加上 ＸｂａⅠ酶切位点后用 ＰＣＲ法扩增，再重组入以抗体库技术筛选得到的人源抗ＨＢｓＡｇ－Ｆａｂ片段表达载体的相应位点上，构建 ａｎｔｉ－ＨＢｓＡｇ－Ｆａｂ／ＩＦＮ－α融合蛋白表达载体。取 ＰＣＲ扩增得到的 ＩＦＮ－α ＤＮＡ，用地高辛标记系统进行化学标记，制备 ＩＦＮ－α ＤＮＡ探针。取构建的融合蛋白表达载体转化受体菌．增菌后，以溶菌酶加煮沸法批量制备载体 ＤＮＡ，点样于硝酸纤维膜上， ８０℃烤２ｈ，预杂交液 ４２℃，２ｈ膜预杂交，标记探针 ４２℃， ４ｈ杂交，洗膜后用酶标抗地高辛抗体显色。同时设单纯人源抗 ＨＢｓＡｇ－Ｆａｂ片段表达载体为阴性对照， ＩＦＮ－α质粒为阳性对照。阳性克隆再以 ＳａｃＩ和 ＸｂａⅠ酶切，琼脂糖电泳鉴定。结果４０株转化细胞中筛选出７个阳性克隆，酶切鉴定显示两者符合率达１００％，成功地筛选出了ａｎｔｉ－ＨＢｓＡｇ－Ｆａｂ／ＩＦＮ－α融合蛋白表达载体。结论人源ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段／ＩＦＮ－α融合蛋白表达载?

抗癌胚抗原纳米抗体与人Fc融合蛋白在毕赤酵母和HEK293细胞中的表达、纯化和性质比较

通过对不同系统表达的肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)纳米抗体与人Fc融合蛋白(11C12-Fc)的表达、纯化及抗体性质等的比较分析,比较不同表达系统的特点及其对融合抗体性质的影响;从而为CEA融合纳米抗体在体内检测方面的应用提供理论依据。构建两种11C12-Fc表达系统(Pichia pastoris和HEK293)相应的表达载体和菌株,分别进行诱导表达、分离纯化;并对其纯化产物的生物学活性等进行初步研究。成功构建了毕赤酵母、HEK293细胞两种CEA纳米抗体融合蛋白(11C12-Fc)表达系统并实现11C12-Fc的胞外分泌表达;通过protein A柱及阴离子交换层析纯化,获得了较高纯度和浓度的11C12-Fc样品;通过突变糖基化位点的方式有效去除了毕赤酵母表达11C12的过度糖基化作用;并且其抗体亲和力较突变前未发生明显改变,与HEK293细胞表达的11C12-Fc都表现出较高的亲和力。毕赤酵母和HEK293系统均能够表达具有较高生物活性的11C12-Fc,后续的科研或生产可根据实际需要和条件来合理选择表达系统。为后续的纳米抗体融合蛋白规模化生产、体内诊断与靶向治疗的应用提供了理论和技术参考。

炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR-Fc在CHO细胞中的表达

ATR_Fc是人炭疽毒素受体(ATR)的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1_227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3.1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR_Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1ATR_Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO_K1细胞中,用G418筛选并获得ATR_Fc表达水平为10～15μg(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR_Fc_1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR_Fc与PA的亲和性,表明ATR_Fc可与PA特异性结合。

高浓度重链抗体可变区-Fc融合蛋白稳定性影响因素分析

目的分析高浓度重链抗体可变区-Fc(variable domain of heavy-chain antibody-Fc,VHH-Fc)融合蛋白稳定性的影响因素。方法设置振摇、光照、40℃高温3组强制降解试验,通过差式扫描荧光法、动态光散射法(dynamic light scattering,DLS)和超高效液相色谱-质谱(ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)法检测3种强制降解条件对高浓度VHH-Fc融合蛋白构象稳定性、胶体稳定性、平均水化动力学直径及翻译后修饰的影响。结果光照条件下,高浓度VHH-Fc融合蛋白的构象展开起始温度(onset temperature of unfolding,Tonset)、熔解温度(melting temperature,Tm)和起始聚集温度(aggregation onset temperature,Tagg)降低幅度最大,Met160和Met266处的氧化比例大幅增加;振摇条件下,扩散相互作用系数(diffusion interaction parameter,kD)和平均水化动力学直径变化量最大。结论光照会显著降低高浓度VHH-Fc融合蛋白的构象稳定性并诱导甲硫氨酸氧化,振摇对其胶体稳定性影响最为显著且会促进聚集。

小鼠IgG2b单克隆抗体Fab、Fc和Fab/c片段的制备和纯化(文摘)

本文报道了用小鼠IgG2b单克隆抗体制备和纯化Fab、Fc和Fab／c片段。由于IgG2b抗体具有对蛋白酶敏感的特性，用胃蛋白酶在酶与抗体之比为1：30，pH4．8的条件下消化抗体．可获得的Fab／c片段产量高达30％。消化液经DEAE—纤维素初步层析，可以含有Fc片段的混合液中分离出Fab片段。

融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP在昆虫细胞中的表达及其靶向结合乳腺癌细胞的功能分析

目的:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达获得携带绿色荧光蛋白(GFP)的抗人表皮生长因子受体2(HER2)的单链抗体可变区片段(ScFv),分析其靶向结合乳腺癌细胞表面受体HER2的功能。方法:构建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,重组获得真核表达载体重组子pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP,转化DH10Bac,收集重组病毒bacmid,分别转染、感染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,SDS-PAGE及Westernblotting分析融合蛋白表达产物。Ni2+-NTA亲和层析法纯化anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白后分别滴入乳腺癌细胞HER2阳性的SKBR3和HER2阴性的MCF7,对比携带绿色荧光的抗HER2单链抗体靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体情况。结果:获得长度约1 539 bp的融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,感染重组病毒的Tn-5B1-4细胞膜附近有明显绿色荧光,SDS-PAGE、Western blotting法检测到60 kD的特异性条带。结合实验显示HER2阳性的SKBR3细胞表面有明显绿色荧光,而HER2阴性的MCF7细胞表面荧光易被洗脱。结论:在Tn-5B1-4中成功表达携带绿色荧光的融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP,该携带绿色荧光的抗HER2单链抗体具有靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体的效能。

抗体药物残留蛋白质A定量检测试剂盒的开发

目的制备能特异识别蛋白质A的多克隆抗体(多抗), 以构建快速、高效、准确的抗体药物中残留蛋白质A定量检测试剂盒。方法使用标准蛋白质A样品进行动物免疫, 获得特异性识别蛋白质A的兔多抗;标记兔多抗并进行抗体配对测试, 构建夹心ELISA试剂盒, 优化试剂盒检测样品的处理方法, 并对试剂盒的稳定性、耐用性、钩状效应、适用性等进行验证。结果多抗制备前对蛋白质A进行热处理11 min时释放率最高, 1#多抗作为包被抗体和2#-Bio作为检测抗体组合构建的试剂盒能够准确检测出蛋白质A, 灵敏度达0.03 ng/ml, 在4 ℃条件下可保存1年。不同反应时间、不同反应温度下的标准曲线的决定系数均大于0.99。检测7款产品的回收率均在80%~120%之间, 对应标准曲线的决定系数均大于0.99。高浓度测试试剂盒时所得光密度值高于标准曲线最高浓度10 ng/ml的值, 待申报样品检测值与回算值一致。结论成功构建了残留蛋白质A的定量检测试剂盒, 该试剂盒的稳定性、耐用性、适用性良好, 且无钩状效应。

木瓜蛋白酶的原位固定化及理化性质研究

以氨基载体原位固定化PEG相中的木瓜蛋白酶,获得了高固定化率（95.9%）和酶活回收率（38.9%）的固定化木瓜蛋白酶,解决了双水相分离纯化后成相聚合物和目的蛋白难以分离的问题。固定化木瓜蛋白酶的最适p H在7.0左右,最适温度处于60-70℃之间。相比游离木瓜蛋白酶,在广泛的p H区间内（3.0-9.0）固定化酶稳定性都较好,热稳定性也有改善。在4℃密闭容器内将固定化木瓜蛋白酶以湿润状态保存可以较好地保留其活性。LH-HA固定化木瓜蛋白酶可以特异性地水解单克隆抗体Ig G,制备Fab和Fc片段。

rhTNFR:Fc对兔正畸微种植体周围炎模型炎症反应的抑制作用研究

[目的]评价注射用重组人Ⅱ型TNF受体-抗体融合蛋白(tumour necrosis factor FC fusion protein,rh TNFR:Fc)(商品名:益赛普)在兔正畸微种植体周围炎模型的作用。[方法]选用新西兰兔12只,随机分为模型对照组和治疗组。分别在兔下颌无牙区植入正畸微种植体,采用钢丝结扎法建立实验性微种植体周围炎模型,结扎56d,治疗组给予rh TNFR:Fc,剂量1.1mg mg/(kg·d)1周,模型对照组给予等量生理盐水,两组在造模后第14、56、63d检测改良菌斑指数(m PLI)、改良龈沟出血指数(m BI)和种植体周探诊深度(PD);造模后63d取种植体周围牙龈行组织病理学检查,常规HE、免疫组化染色,观察炎性细胞浸润及TNF-α分布情况。[结果]造模后63d,治疗组m PLI、m BI、PD较模型对照组均明显下降(P<0.05)。组织病理学检查显示:造模后63d治疗组牙龈组织内炎症细胞浸润、TNF-α均较模型对照组减少(P<0.05)。[结论]rh TNFR:Fc可影响微种植体周围炎炎症反应过程。

应用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体Fc融合蛋白治疗非全身型幼年特发性关节炎患者的护理

目的总结重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体Fc融合蛋白治疗非全身型幼年特发性关节炎的护理体会。方法对32例非全身型幼年特发性关节炎患儿使用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体Fc融合蛋白进行治疗，着重加强了用药不良反应的观察，用药指导。同时进行了心理护理、饮食指导、关节功能锻炼、康复指导等护理。结果使用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体Fc融合蛋白治疗非全身型幼年特发性关节炎安全、有效，给予正确的护理后不良反应发生率低。结论在使用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体Fc融合蛋白治疗非全身型幼年特发性关节炎时，应着重患儿的用药护理，使患儿了解疾病的相关知识、用药的重要性和注意事项，增加患儿的依从性，减少不良反应的发生，提高疗效，从而有效提高患儿的生活质量。

治疗性抗体Fc融合蛋白药物研究进展

抗体融合蛋白已成为生物工程治疗药物中最成功的一员.其中的Fc融合蛋白,是一类通过基因工程平台技术将抗体的Fc部分与药物的活性成分融合表达而产生的蛋白.虽然构建Fc融合蛋白的初衷是为了延长其半衰期,但大量研究表明,Fc部分也参与免疫调节过程,引起一些免疫效应.随着生物治疗药物研究的飞速发展,Fc融合蛋白药物研究也取得了很大进展.此文从Fc融合蛋白的设计目的、设计原理、作用机理以及质量控制方面,对治疗性Fc融合蛋白药物的研究进展做一介绍.

新型冠状病毒受体结合域-Fc融合蛋白表达及小鼠免疫原性

目的表达制备新型冠状病毒刺突蛋白的受体结合域(receptor binding domain, RBD)-Fc融合蛋白, 并评价其在小鼠模型中的免疫原性。方法将新型冠状病毒RBD与小鼠免疫球蛋白Fc段融合基因在中国仓鼠卵巢细胞中表达并制备融合蛋白。将不同剂量的RBD-Fc融合蛋白分别单独或辅以氢氧化铝佐剂免疫小鼠, 通过ELISA、假病毒中和试验、酶联免疫斑点试验检测诱导产生的体液和细胞免疫应答。结果 10 μg RBD-Fc融合蛋白辅以氢氧化铝佐剂能有效诱导小鼠产生良好的RBD特异性IgG抗体应答, 该抗体可阻断病毒RBD与细胞表面病毒受体的结合, 进一步研究表明该重组蛋白还诱导产生了针对原始毒株、Beta变异株和Delta变异株假病毒的中和抗体, 中和抗体滴度分别为1 566、336和270。结论制备的RBD-Fc融合蛋白具有较好的免疫原性, 可为开发COVID-19重组蛋白疫苗提供参考。

人源抗Met基因工程抗体scFv的改造与特性分析

目的:将已制备的抗Met单链抗体基因与人IgGFc基因片段融合,表达有活性的融合蛋白分子,以增强单链抗体的可溶性。方法:从人淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增并制备人IgG的Fc基因片段,并克隆于已构建好的pBAD-scFv原核表达载体中,转化大肠杆菌Top10,经阿拉伯糖诱导表达融合蛋白scFv-Fc。所表达的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE、Westernblot分析鉴定,并用ELISA检测抗体效价。结果:序列分析表明重组质粒pBAD-scFv-Fc基因序列正确;SDS-PAGE分析表明,scFv-Fc融合蛋白分子量为60ku,且为可溶性蛋白;该蛋白经过His亲和层析纯化、ELISA检测,结果表明,该融合蛋白能够与抗原分子Met特异性结合。结论:改造后的抗体融合蛋白scFv-Fc能与人Met特异性结合,增加了抗体蛋白溶解度,有利于抗体的大量制备。

人类免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白(Gag)在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白Gag,为HIV感染的诊断和疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增获得HIV1gag基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX5X1的tac启动子下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westernblot分析验证其表达产物。结果表达产物是相对分子质量为82000的GST融合蛋白,且能与抗p24单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Gag蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达,且具有良好的抗原性,可进一步用于HIV感染及动物免疫等方面的研究。

抗体药物的发展与应用

早期抗体药物是鼠源单克隆抗体,存在免疫原性强、半衰期短等问题。历经数十年的发展,抗体药物从最初的鼠源单抗,逐步发展为人鼠嵌合抗体、人源化抗体及全人源化抗体。通过片段重组、位点修饰、药物偶联等方法,科研人员研发了包括抗体融合蛋白、抗体偶联药物、双特异性抗体、小分子抗体片段等形式多样的抗体药物。抗体药物在恶性肿瘤、自身免疫病、感染性疾病的治疗上发挥重要作用。通过对抗体药物人源化历程,不同类型的抗体结构和特点,以及抗体药物在新型冠状病毒肺炎治疗中的应用进行综述,并对抗体药物的发展前景进行展望,以期为我国抗体药物的研发提供参考。

Fc融合蛋白在药学领域的研究进展

Fc融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物活性的功能蛋白分子与Fc片段融合而产生的新型重组蛋白,其不仅保留了功能蛋白分子的生物学活性,还具有一些抗体的性质,如通过结合相关Fc受体延长半衰期和引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性效应等。对Fc融合蛋白及其在药学领域的研究进展进行了综述。

人IgG Fc标签融合表达载体的构建及H5 HA1融合蛋白的表达

目的构建人IgG Fc标签融合表达载体,表达并纯化H5 HA1融合蛋白。方法以pCAGGS载体为基础,依次插入IL-2信号肽及人IgG Fc片段,构建人IgG Fc标签融合表达载体。将H5 HA1克隆至含人IgG Fc标签的融合表达载体pCAGGS-F-IL-2/Fc中,瞬时转染293T细胞,进行融合蛋白的表达。表达的蛋白经Protein G亲和层析一步法纯化。结果人IgG Fc标签融合表达载体经酶切及测序证明构建正确;在293T细胞中分泌表达的H5 HA1与人IgG Fc的融合蛋白HA1-Fc相对分子质量约75 000,转染后72和96 h表达量最高;纯化的融合蛋白纯度达90%以上,含量为1.63μg/ml。结论成功构建了人IgG Fc标签融合表达载体,表达并纯化了HA1-Fc融合蛋白,为流感病毒侵入及免疫机制的研究奠定了基础。

长效重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺的建立

目的建立长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的纯化工艺。方法rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经离心、低pH处理、过滤、浓缩预处理后,再经Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析进行纯化,同时检测rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量、纯度、等电点及宿主蛋白、宿主DNA、Protein-A残留量等指标。结果Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145、132、92.4 mg,纯度分别为95.40%、95.90%和99.19%,宿主蛋白残留量分别为2500、864和71 ng/mg,宿主DNA残留量分别为329、0.56和0.12 ng/mg,Protein-A残留量分别为24.5、3.2和0 ng/mg。rhGH-Fc融合蛋白相对分子质量约97300,等电点范围为5.5~6.5,可与鼠抗人生长激素(human growth hormone,hGH)抗体发生特异性结合。结论成功建立了rhGH-Fc融合蛋白的纯化工艺,该工艺的纯化产物回收率及纯度均较高,本实验为rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了理论基础。

全柱成像毛细管等电聚焦(iCIEF)技术分析重组人IgG VEGFR:Fc-融合蛋白电荷异质性

目的:建立全柱成像毛细管等电聚焦法(iCIEF)分析重组人IgG VEGFR:Fc-融合蛋白(血管内皮生长因子受体-抗体Fc融合蛋白)的电荷异质性。方法:首先对全柱成像毛细管等电聚焦方法在蛋白浓度、助溶剂、两性电解质、聚焦时间等方面进行了条件优化。并应用优化的方法进行Fc-融合蛋白的电荷异质性及等电点检测及重复性验证,并将结果与毛细管等电聚焦(cIEF)及平板胶等电聚焦(IEF)结果进行对比分析。结果:在优化的实验条件下,分析Fc-融合蛋白的电荷异质性及等电点具有良好的分离度和重复性,分离效果明显好于cIEF和IEF,且主成分的pI重复测定RSD均小于0.5%。结论:iCIEF作为一种新的技术手段,用于重组蛋白类药物电荷异质性及等电点分析,方法快速、准确,重复性好,能够较好地检测高度糖基化的重组VEGFR:Fc-融合蛋白产品的电荷异质性,为保障Fc-融合蛋白类产品生产工艺的稳定性及质量控制提供了一种快速、可靠的分析方法。