丝素蛋白的抗冻活性探析

为制备可量产、成本低且高效的低温保护剂,研究一种源于家蚕茧的丝素蛋白的抗冻活性。借鉴抗冻蛋白的研究方法,先制备实验溶液,再通过质谱分析和色谱测定来分析丝素蛋白的分子量、氨基酸组成以及二级结构,通过冰晶重结晶抑制实验分析丝素蛋白溶液的抗冻活性。结合丝素蛋白的氨基酸组成与结构等信息分析丝素蛋白作为低温保护剂的保护机制。研究结果表明,丝素蛋白中的β-折叠结构有助于丝素蛋白与冰晶充分结合,丝素蛋白分子吸附于冰的生长表面,侧链上的β-折叠结构与冰晶结合,还可以通过分子间的疏水作用吸附到冰晶表面,通过覆盖和屏蔽作用抑制冰晶生长。这种抗冻活性随着丝素蛋白溶液质量浓度的增加而增强。

鱼糜副产物蛋白水解物的抗冻活性及对嗜热链球菌的抗冻效果及机制

研究鱼糜加工副产物蛋白水解物(surimi by-product protein hydrolysate,SBPH)的结构与抗冻活性,并通过测定嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)在冷冻处理后的生长性能、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、相关蛋白酶活力、代谢活性与膜电势等指标探究SBPH对嗜热链球菌的抗冻作用机制。结果表明,SBPH的分子质量范围为260~2 550 Da,共鉴定出78个氨基酸长度为8~18的肽段,部分肽段具有三肽重复序列的特征结构,赋予SBPH较高的抗冻活性(热滞活性为1.76℃)。与其他抗冻剂(蔗糖、脱脂牛乳、甘油)相比,SBPH(质量浓度2 mg/mL)可提升冷冻处理后嗜热链球菌的细胞存活率、生长活性和细胞酸化活性,并且SBPH可减轻低温对细胞造成的氧化应激损伤,显著抑制相关蛋白酶活力的下降(P<0.05),并提升细胞代谢活性,减轻细胞膜的超极化,利于保持细胞膜的完整性和流动性。SBPH可在一定程度上维持磷脂双分子层间的作用力,保护细胞膜的结构。综上所述,SBPH可保护细胞的功能和完整性,在一定程度上降低了细胞的低温损伤。

新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因的克隆和抗冻活性分析

根据GenBank中已发表的昆虫抗冻蛋白基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR技术结合3’-RACE扩增的方法,从新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲Microderapunctipenisdzunarica中获得了长约294bp不含信号肽的抗冻蛋白cDNA片段,命名为MpAFP5,其全长序列为363bp(GenBank注册号为AY821792)。基因测序结果表明,MpAFP5cDNA片段与加拿大拟步甲DendroidescanadensisAFP8基因片段、黄粉甲TenebriomolitorTHP4-9基因片段的核苷酸同源性分别达68.4%和71.8%,氨基酸序列同源性分别达70%和81%。将MpAFP5构建到原核表达载体pGEX4T-1中,重组质粒pGEX4T-1-MpAFP5在大肠杆菌BL21(DE3)中能够表达融合抗冻蛋白,SDS-PAGE分析显示融合蛋白的分子量约为37kD,Western印迹分析证明MpAFP5在大肠杆菌中正确表达。细菌的抗冻实验结果显示准噶尔小胸鳖甲融合抗冻蛋白对细菌具有显著的抗冻保护作用,保护效果与抗冻蛋白剂量呈正相关性。

不同来源胶原蛋白抗冻活性的研究

采用酶法制备不同来源的胶原蛋白,并对其纯度及氨基酸组成进行鉴定。在此基础上,利用差示扫描量热仪及低温显微镜对其热滞活性(thermal hysteresis activity,THA)和重结晶抑制效应(ice recrystallization inhibition,IRI)进行了研究。结果表明:所制备的胶原蛋白均为典型的Ⅰ型胶原,纯度较高,其分子质量约为330 kD;相比于牛血清白蛋白,不同来源的胶原蛋白中,猪皮胶原具有较高的热滞活性,即当保留温度为-0.2℃,体系冰晶含量φ≤5%时,THA为0.52℃;在猪皮胶原蛋白体系中形成的冰晶为不规则的圆球形,不易对细胞及组织造成伤害,且经过一次循环后,冰晶无显著增大。

胶原酶解复合物的制备及其抗冻活性

以水解度为指标,优化了碱性蛋白酶水解猪皮胶原蛋白的条件。在此基础上,制备了不同水解度的酶解复合物,并对其抗冻保护活性进行了研究。结果表明,酶浓度5%(w/v),酶解温度50℃,酶解时间5 h,p H值8.0,胶原质量浓度为15 mg/m L可得到最高水解度,为猪皮胶原蛋白最佳的酶解条件。在此条件下制备水解度分别为4%、6%、8%、10%、13%和16%的酶解复合物,发现水解度为10%的酶解复合物,在使用质量浓度为1.2 mg/m L时对微生物的保护活性最高。该水解度的酶解复合物还能显著抑制冰淇淋的重结晶,并具有较高的热滞活性,为4.64℃,其分子质量主要分布在小于1 000 Da范围内。

重组抗冻肽在乳酸乳球菌中表达及其抗冻活性研究

为了优化抗冻蛋白SF-P的重组表达,利用乳酸链球菌素Nisin对已构建的重组乳酸乳球菌进行表达。通过对诱导时间、诱导pH、诱导温度和诱导剂Nisin浓度等诱导表达条件进行优化,利用SDS-PAGE和Western blot确定最佳的表达条件;通过比较冷冻胁迫前后菌体的生长状况、发酵活力和细胞内钠钾离子含量的变化,研究重组菌在冷冻胁迫作用下的生理功能特性。结果表明:优化后的最佳表达条件为pH 7.0,诱导剂Nisin浓度15ng/mL,温度25℃,诱导时间6h;SF-P2诱导重组菌株可以显著改善乳酸菌由于经受冷冻胁迫导致的对数生长延滞期和稳定生长延滞期的增加,表现出较强的酸化活力,并且可以有效降低冷冻胁迫过程对乳酸菌细胞膜通透性的影响,起到保护细胞生理功能的作用,表明SF-P2诱导重组菌具有显著的抗冷冻胁迫保护作用。

抗冻蛋白抗冻活性评价方法的研究进展

抗冻蛋白(AFPs)因其独特的结构和功能特性受到日益广泛的关注。抗冻活性的评价是AFPs研究的关键步骤之一,评价结果的准确性、精确性和可比性直接影响AFPs的后续研究。本文综述了AFPs抗冻活性评价方法的基本原理、分析、比较了不同评价方法之间的优势、不足。未来AFP抗冻活性评价方法发展的重点在于评价方法的标准化,精确性和重现性方面,以期能够推动AFPs研究的发展。

鱼类抗冻蛋白结构与抗冻活性的关系

抗冻蛋白通过不可逆附着于冰特定表面来有效抑制冰晶生长和重结晶,具有很强的抗冻活性。本文选取若干代表性鱼类抗冻蛋白为例,阐述6类鱼类抗冻蛋白的结构特性(氨基酸残基组成与特定序列、二级结构组成以及蛋白的空间构象等)、稳定蛋白结构的重要因素以及分子中参与冰晶结合的氨基酸残基位点,重点揭示蛋白结构与抗冻活性的内在关系,以期为将来的广泛应用提供一定理论基础。

丝胶抗冻肽在大肠杆菌中的重组表达及其抗冻活性初探

为了高效制备抗冻肽,研究一种丝胶抗冻肽目的基因SerD在大肠杆菌BL21菌株中的重组表达,并分析表达产物的抗冻活性。首先合成SerD基因片段,经KpnI和XhoI双酶切后定向插入质粒载体Pet32a中,构建表达质粒Pet32a-SerD,然后电转化入大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行目的基因表达,利用镍琼脂糖亲和层析对目的重组蛋白进行纯化,并对其进行抗冻活性分析。结果表明,最佳表达条件为重组菌在20℃诱导16 h;通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹试验(Western-Blot)鉴定重组蛋白表达成功且His-SerD融合蛋白表达的分子量在25～35 kDa之间;胞内表达His-SerD融合蛋白的大肠杆菌BL21-SerD复苏后的生长活性明显高于PBL空载菌;添加His-SerD融合蛋白可明显降低溶液中冰晶颗粒大小,具有较好的重结晶抑制效果。本文通过基因工程方法在大肠杆菌中成功构建丝胶肽抗冻肽的重组表达系统,并最终获得具有抗冷冻胁迫保护作用的His-SerD融合蛋白。

赤翅甲抗冻蛋白基因的原核表达及蛋白生物活性检测

根据GenBank中序列人工合成赤翅甲 Dendroides canadensis 的抗冻蛋白基因 (afp), 将其克隆到载体 pGEX_4T_1上, 构建融合表达的重组质粒, 转化大肠杆菌 BL21并进行原核表达。通过优化表达的诱导条件和SDS_PAGE检测, 证明人工合成的赤翅甲抗冻蛋白基因能够特异性地表达, 并以可溶性融合蛋白形式存在, 相对分子质量约为40 kD。抗冻蛋白的生物活性检测表明, 赤翅甲的抗冻融合蛋白能够提高细菌的耐寒能力。

黄粉甲抗冻蛋白AFP84a在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

为表达和纯化黄粉甲Tenebrio molitor抗冻蛋白,采用RT-PCR方法扩增得到黄粉甲抗冻蛋白基因afp84acDNA,将其连接到pMAL-p2X质粒上,构建分泌型融合表达载体pMAL-p2X-afp84a,并在大肠杆菌Escherichia coli TBI中表达;进一步利用Amylose柱亲和纯化出该重组蛋白,后利用细菌抗寒性检测重组蛋白的生物活性。。结果显示:融合蛋白含量占总可溶蛋白的40%。SDS-PAGE分析表明,用MgSO4处理法与超声波细胞破碎法均可使融合蛋白从细胞中释放;融合蛋白经Amylose柱亲和纯化,FactorXa因子酶切,电泳显示获得的目的蛋白呈单一条带。细菌抗寒性检测表明该重组蛋白具有较高的抗冻活性。黄粉甲抗冻蛋白基因afp84acDNA的克隆、原核表达为进一步研究抗冻蛋白的性质和应用提供了有用的实验材料。

两种昆虫抗冻蛋白抗冻活性差异的分子基础

云杉蚜虫(Choristoneura fumiferana)体内可产生一种抗冻蛋白(AFP),能够保护其在寒冷的冬季安全越冬,这类昆虫抗冻蛋白(简称CfAFP)存在多种异构体,其中CfAFP-501和CfAFP-337均呈现相似的左手β-螺旋结构.实验测定,相比CfAFP-337仅多出两个插入螺旋环的CfAFP-501的抗冻活性竟然是CfAFP-337的3倍左右.蛋白异构体CfAFP-501显著增强的抗冻活性和它的插入环数不成比例,当然也不能简单归因于两个插入环所导致的与冰晶作用部位及接触面积的增加.为了探讨两种昆虫抗冻蛋白异构体抗冻活性差异的分子基础,深入了解抗冻蛋白作用特点的普遍规律,分别使用分子力学、分子动力学模拟和量子力学方法来系统研究蛋白及其切割体与冰晶结合的结构特征及相互作用.结果表明,CfAFP-501中多数螺旋环比CfAFP-337具有更强的冰晶相互作用和破坏冰晶中水分子的成键的能力,由于螺旋长度增加导致CfAFP-501中各β-螺旋环之间协同效应的增强,是其具有显著增强的抗冻活性的主要来源.这种协同作用对具有β-螺旋结构的抗冻蛋白起十分关键的作用和重要贡献.

抗冻蛋白活性的吸附动力学模型

根据抗冻蛋白溶液中抗冻蛋白分子与冰晶表面相互作用特点,提出抗冻蛋白与冰晶表面相互作用模型.进而,利用饱和分数与抗冻活性之间的关系,给出抗冻活性与抗冻蛋白浓度的理论关系.根据此关系做出了与实验数据符合较好的抗冻活性与抗冻蛋白浓度关系的理论曲线.另外,对抗冻蛋白分子与冰晶表面相互作用的特点作了进一步的讨论.

寒地冬小麦冰结构蛋白对冷冻豆腐品质及蛋白性质的抗冻保护作用

冷冻豆腐经常出现质地粗糙、孔径不均、甚至断面等品质问题。该研究采用冰球结合磷酸盐缓冲液法提取寒地冬小麦冰结构蛋白(Winter Wheat Ice Structural Proteins,WISPs),经检测热滞性为0.46℃,其溶液的冰晶形态小、数量多,具有一定的抗冻活性。在不同添加量WISPs各组冷冻豆腐中,当添加质量分数为1.00%时,其持水率、复水性、耐煮性及弹性、拉伸性较对照组分别提高了114.17%、57.42%、56.25%、21.52%、23.71%,硬度、剪切力降低了24.83%、23.75%;结合水、半结合水、不易流动水含量增加了133.77%、131.78%、26.41%;横截面光滑细腻,蜂窝均匀,孔径大小适中。此时冷冻豆腐蛋白游离疏基含量较对照组增加了37.50%,二硫键含量减小了29.79%;对照和0.25%组中90 ku以上的组分全部降解;除0.75%和1.00%组外,其余各组的BS亚基中低分子量组分降解;各组中AS、BS亚基含量均少于1.00%组,说明1.00%组的蛋白组分最稳定。WISPs作为抗冻保护剂,改善了冷冻豆腐的品质和蛋白质结构特性,对其具有抗冻保护作用,为抗冻蛋白在冷冻食品中的应用提供了理论基础。

苜蓿冰结构蛋白抗冻活性及功能性研究

以"肇东"紫花苜蓿干草为原料,采用磷酸盐缓冲溶液法提取苜蓿冰结构蛋白,研究了温度、pH值、NaCl及蔗糖浓度不同提取因素对苜蓿冰结构蛋白功能的影响。结果表明:苜蓿冰结构蛋白溶液的冰晶体积小、数量多、形状不规则,具有很好的抗冻活性;对苜蓿冰洁构蛋白的功能性进行测定,随着溶液pH值的增加,其溶解指数、持水性、乳化性和乳化稳定性、起泡性与泡沫稳定性都呈现出逐渐增大的趋势;随着NaCl浓度的增加,其起泡性和泡沫稳定性先增加后降低、乳化性和乳化稳定性呈现下降趋势;随着蔗糖浓度的增加,其蛋白起泡性和泡沫稳定性逐渐增加,而乳化性和乳化稳定性影响不大。

DSC法检测抗冻蛋白的热滞活性的研究

以胡萝卜抗冻蛋白(DcAFP)为研究对象,结合相关文献报道,应用差示扫描量热法(DSC)研究其抗冻活性,对可能影响到其抗冻活性的因素做了全面的考察,以建立一个有效测定热滞活性的标准方法。实验结果表明,差示扫描量热法测定DcAFP的热滞活性具有较高的稳定性(利用差示扫描量法每隔一段时间测定相同的样品时,所得的抗冻蛋白的抗冻活性在统计学上没有显著差异,说明该方法的稳定性好),重复性(相对标准偏差(RSD)均小于0.4%,0.137%<RSD<0.369%)和精密度(RSD=1.42%)。

鱼源Ⅲ型抗冻蛋白的生物学活性

为了通过细菌低温保护实验测定鱼源Ⅲ型抗冻蛋白(AFPⅢ)对大肠杆菌的低温保护效果,利用前期构建的原核表达质粒pET32a(+)-AFPⅢ转化大肠杆菌,目的蛋白以融合his标签的形式在大肠杆菌中表达,经NI柱亲和层析得到较高纯度的AFPⅢ-his融合蛋白。细菌抗冻实验的结果表明,外加一定浓度范围内的纯化的AFPⅢ融合蛋白对细菌有明显保护作用,但是抗冻蛋白的浓度对细菌的保护力不成一致的线性关系。鱼源Ⅲ型抗冻蛋白的浓度在50μg/mL时抗冻效果最好,并且随着温度的下降,抗冻蛋白对细菌的保护能力与Glycerol对细菌的保护能力的差距逐渐减少,在-80℃时基本可以代替甘油用于菌种保存。

冷冻工艺条件对发酵面团中抗冻酵母活性的影响

研究了冷冻面团的冷冻终结温度、冻藏温度、冻藏时间对抗冻酵母活性的影响,得出最有利于抗冻酵母活性保持的冷冻工艺条件:冷冻终结温度-18℃,冻藏温度应与冷冻终结温度保持一致,贮存时间不超过30d为宜。

抗冻蛋白与冰-水界面层相互作用的理论机制研究进展

抗冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs)具有热滞活性和重结晶抑制活性,在冷冻食品品质调控、细菌低温保护、植物霜冻保护等领域具有广泛的应用价值。本文围绕种类和结构复杂的AFPs在低温冷冻环境下如何通过调控冰-水界面层结构、与冰晶结合或相互作用从而实现其抑制冰晶生长、产生热滞活性和重结晶抑制活性的理论问题,系统综述了吸附-抑制模型、偶极子-偶极子模型、晶格匹配与占有模型、刚体能量模型、包合物锚定模型、亲和相互作用偶联团聚模型等理论模型原理和特点,揭示了AFPs通过调控冰-水界面层结构产生结合或相互作用的原理及其驱动力作用特点,为解析AFPs抗冻活性机理及其筛选、食品工业应用提供理论参考。

新疆沙冬青叶片氨基酸和蛋白质的测试与分离以及抗冻蛋白的鉴定结果分析

提取并纯化了新疆沙冬青（Ammopiptanthus nanus）叶片总蛋白,得到了适合新疆沙冬青叶片总蛋白提取的最佳缓冲体系;用DEAE52-C分离了各蛋白质组分,并用SDS-PAG测定了纯度和分子量（14～90 kD之间）;氨基酸组成分析显示了新疆沙冬青属内种遗传的一致性。对抗冻活性分析讨论证实了与蒙古沙冬青同属的新疆沙冬青中也含有抗冻蛋白（AFPs）。