水蛭抗凝活性检测两种滴定方法比较

目的:比较药典标准凝血酶滴定法和白瓷板法对中药水蛭抗凝活性检测结果的影响。方法:分别采用《中国药典》中凝血酶滴定法和云南省《菲牛蛭冻干粉中药饮片炮制规范征求意见稿》中白瓷板法对水蛭抗凝活性进行多次平行滴定实验。结果:抗凝活性成分含量较高的菲牛蛭其药典法滴定结果重复性更稳定,白瓷板滴定法结果的重复性会随着单次进样量减少而趋于稳定;宽体金线蛭的抗凝活性结果在两种方法的对比检测下均较为稳定。结论:对于吸血水蛭品种抗凝活性的测量,建议保留原凝血酶滴定法;对于抗凝活性较低,实验中凝血酶溶液浓度较小的水蛭品种,两种滴定法均适用,也可同时应用互相验证。另在滴定操作中,将反应试管改换成玻璃液相进样瓶,且在滴定动作后将反应容器呈一定角度倾斜放置,有助于对反应终点进行判断,提高实验结果的准确性和稳定性。

通俗环毛蚓、参环毛蚓、赤子爱胜蚓的分子鉴定及纤溶、抗凝活性对比

目的 鉴定参环毛蚓、通俗环毛蚓以及药典外研究较多的赤子爱胜蚓,再比较3种鲜体蚯蚓在两种不同提取方法下的纤溶和抗凝活性,并检测乙醇沉淀物的分子量。方法 采用DNA分子鉴定法鉴别3种蚯蚓。采用水提法提取鲜体蚯蚓蛋白,进一步采用乙醇沉淀法对水提物中的蛋白进行富集,利用纤维蛋白平板法和纤维蛋白原-凝血酶时间法(Fibg-TT法)测定纤溶活性和抗凝活性,利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测3种蚯蚓乙醇沉淀物的分子量。结果 以线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(COI)基因片段为识别片段准确鉴定出了3种蚯蚓。比较3种蚯蚓水提液的抗血栓活性:参环毛蚓水提液的抗凝活性和纤溶活性最强,而赤子爱胜蚓水提液活性最弱;比较3种蚯蚓乙醇沉淀物的抗血栓活性:参环毛蚓乙醇沉淀物的纤溶活性最强,而通俗环毛蚓乙醇沉淀物的抗凝活性最强;赤子爱胜蚓的乙醇沉淀物纤溶和抗凝活性均最弱。参环毛蚓和通俗环毛蚓乙醇沉淀物的蛋白分子量主要分布在25~70 kDa,赤子爱胜蚓乙醇沉淀物的蛋白分子量主要分布在25~40 kDa。结论 药典地龙品种通俗环毛蚓和参环毛蚓的纤溶、抗凝活性远大于药典外的常用品种赤子爱胜蚓,3种蚯蚓中抗血栓活性蛋白有明显差异;乙醇沉淀法可有效富集抗血栓蛋白。

基于分子模拟技术筛选宽体金线蛭抗凝活性肽

目的:采用分子模拟技术从宽体金线蛭来源多肽库中筛选抗凝活性多肽,结合分子对接初筛及分子动力学模拟复筛,最终通过抗凝实验验证得到宽体金线蛭抗凝活性多肽。方法:利用虚拟酶切技术对宽体金线蛭蛋白库进行酶切,得到宽体金线蛭多肽候选库;选择凝血酶为凝血活性靶点,采用HPEPDOCK及Discovery Studio CDOCKER两种方法进行分子对接,并利用分子动力学模拟技术对分子对接初筛结果中对接结合能高的复合物进行动力学模拟复筛,通过MM-PBSA模块分析计算凝血酶-多肽复合物结合自由能;最后采用固相合成法化学合成复筛中稳定结合的宽体金线蛭多肽并进行体外抗凝活性测定。结果:经过虚拟酶切共得到3317条无毒多肽,通过分子对接进行初筛,结合分子动力学模拟复筛,得到1条结合凝血酶效果最好的目标抗凝肽,该多肽序列为QNTVGLDDFFSSYER,结合自由能为-427.506 kJ·mol^(-1)。凝血酶Arg233残基是该凝血酶-多肽复合物中介导结合相互作用的关键氨基酸。该宽体金线蛭抗凝肽在体外活性测定中确能延长凝血酶时间。结论:利用分子模拟技术有效筛选出1条宽体金线蛭抗凝活性肽,并经过抗凝实验验证,表明“模拟+实验”的活性肽筛选策略切实可行,该研究思路可为动物类中药物质基础研究提供参考。

蜗牛黏液糖胺聚糖的化学结构及抗凝活性

研究了白玉蜗牛黏液中糖胺聚糖的化学结构及其对血液凝固的影响.采用酶解法提取白玉蜗牛黏液粗多糖,季铵盐沉淀法和离子交换柱层析法纯化获得多糖SMG-2.单糖组成分析以及紫外、红外、核磁共振等波谱方法对SMG-2的化学组成与结构进行分析研究,体外抗凝血实验分析SMG-2对人质控血浆凝血时间的影响.结果表明,SMG-2由L-艾杜糖醛酸和D-乙酰氨基葡萄糖组成的类肝素糖胺聚糖,因其肝素抗凝五糖序列而无显著抗凝血活性.

无舌川西小黄菊的抗炎及促凝和抗凝活性的初步测试

目的:对怒族民间草药无舌川西小黄菊的总醇提取物和乙酸乙酯萃取部分进行抗炎、抗氧化及促/抗凝血活性体外活性测试,测定了其总黄酮含量,并对其精油成分进行分析。方法:以巨噬细胞RAW264.7为实验细胞株,通过检测NO浓度评估抗炎活性。通过血小板聚集实验评价诱导血小板聚集活性;通过体外凝血实验研究抗凝血活性。以紫外分光光度法测定其总黄酮含量,以DPPH法测定总黄酮的抗氧化活性。通过气相色谱-质谱联用技术分析其精油化学成分。结果:无舌川西小黄菊总醇提取物和乙酸乙酯萃取物均有显著的抗炎活性。但只显示微弱的抗凝血活性,没有显示出血小板聚集活性。其总黄酮含量较高,具有良好的自由基清除能力。从其精油中分离了37个组分,鉴定了其中30个。结论:为进一步合理开发和利用无舌川西小黄菊资源提供了数据支撑。

重组水蛭素体内抗凝活性的实验研究

目的 研究重组水蛭素的抗凝活性 ,为水蛭素新药开发提供实验依据。方法 家兔 iv重组水蛭素前及后心脏采血 ,应用血凝仪测定凝血酶时间 (TT)、凝血酶原时间 (PT)和活化的部分凝血活酶时间 (APTT) ,并考察其抗凝活性的量效和时效关系。结果 重组水蛭素能明显延长 TT和 APTT,且呈剂量依赖性 ,但在所试剂量范围内对 PT无明显影响 ;其延长 TT和 APTT的作用随时间而下降 ,作用持续时间约 6 0 m in。结论 重组水蛭素具有明显抗凝作用 ,明显强于现有抗凝药肝素 ,且其作用强度与同剂量德国产基因重组水蛭素

水蛭头、尾抗凝活性的比较及晾干后对活性的影响

水蛭头、尾抗凝活性的比较及晾干后对活性的影响汪文茉张秋海欧兴长（中国中医研究院基础理论研究所北京１００７００）为考察水蛭哪个部位作用最强及晾干后对活性的影响，我们测定了两种吸血水蛭（菲牛蛭和日本医蛭）的头部、尾部及其全体的比活性。并比较了干品全体和鲜...

线虫抗凝血蛋白AcaNAP7基因克隆、表达及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达犬钩虫线虫抗凝血蛋白NAP7(AcaNAP7)成熟蛋白,并鉴定表达产物的抗凝活性。方法根据AcaNAP7的核苷酸序列设计引物,从克隆质粒pUCm-T/AcaNAP7中扩增编码AcaNAP7成熟蛋白的基因;扩增产物经双酶切定向克隆到原核表达载体PET-32a中;构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝血活性。结果克隆了编码AcaNAP7成熟蛋白的基因并构建了重组表达质粒pET-32a/AcaNAP7;在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达了融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白,产物主要以可溶形式存在;镍琼脂糖凝胶亲和纯化获得了纯度高达92%的目的蛋白;纯化产物能明显延长PT及aPTT,其延长PT比延长aPTT更有效。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP7融合蛋白,表达产物具有抗凝活性。该实验为进一步研究AcaNAP7的功能及应用奠定了基础。

水蛭不同提取物抗凝活性的体外实验研究

目的 :研究水蛭不同提取物的抗凝活性 ,为水蛭的新药开发提供实验依据。方法 :Wistar大鼠腹静脉取血 ,应用血凝仪体外测定凝血酶原时间 (PT)、凝血酶时间 (TT)和活化的部分凝血活酶时间 (APTT)。结果 :水蛭的乙酸乙酯部分能使大鼠的PT、TT、APTT显著延长。正己烷部分、水溶液部分能使大鼠的PT显著延长 ,正丁醇部分能使大鼠的APTT显著延长。结论 :水蛭各提取物均有抗凝活性 ,水蛭中存在不同于水蛭素的新的抗凝血成分.

十二指肠钩虫抗凝蛋白AduNAP7的原核表达、纯化及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达十二指肠钩虫抗凝蛋白AduNAP7并鉴定抗凝活性。方法运用RT-PCR扩增十二指肠钩虫抗凝蛋白AduNAP7成熟蛋白及其组成肽段AduNAP7A、AduNAP7B的编码序列;将编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a及pICET32,构建重组表达质粒;成功构建的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达;用镍亲和层析一步纯化融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白;先后用几丁质亲和层析及镍亲和层析两个步骤纯化自切割后带6×his-tag的目的蛋白;用凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)检测纯化表达产物的体外抗凝活性。结果获得AduNAP7、AduNAP7A及AduNAP7B的编码序列并成功构建了原核表达重组质粒;AduNAP7、AduNAP7A及Adu-NAP7B均在大肠中得到了高效可溶表达,纯化产物具有一定抗凝活性,它们延长aPTT比延长PT更有效。AduNAP7B的抗凝活性显著强于AduNAP7及AduNAP7A。结论AduNAP7具有较强抗凝活性,但显著弱于AcAP5、AcaNAP7及AcAPc2。AduNAP7的抗凝效应可能利于钩虫在人体内的吸血寄生生活,其抗凝作用机制有待进一步研究。

不同提取方法对水蛭、土鳖虫、蜈蚣抗凝活性的影响

目的观察不同提取方法以及酸、碱、反复冻融对水蛭等3种中药抗凝活性的影响。方法以TT为指标,考察不同提取方法,以及酸、碱和反复冻融法对水蛭、土鳖虫、蜈蚣提取液中抗凝物质的影响。结果冷浸法抗凝活性明显优于煎煮法和冻融法,其抗凝活性不受pH影响,经酸碱处理后TT无明显变化(P>0.05),土鳖虫、蜈蚣提取液的凝血酶时间与冻融次数无关(P>0.05),水蛭凝血酶时间易受冻融次数影响(P<0.05)。结论3种提取方法以冷浸法提取最优,酸碱和反复冻融影响其药抗凝活性。

日本医蛭抗凝活性研究

目的:研究分析人工养殖条件下日本医蛭活体、干品的抗凝活性,为日本医蛭合理入药提供参考。方法:根据中国药典规定,采用凝血酶滴定法对不同处理的日本医蛭样品进行测试。结果:发现日本医蛭抗凝活性依次为超低温冻干品、鲜品、晒干品。结论:保证日本医蛭最佳抗凝活性的方法为超低温冻干。

僵蚕抗凝活性提取液的氨基酸分析

目的:研究僵蚕中具有抗凝活性的提取液中蛋白质的氨基酸残基种类与含量,为僵蚕抗凝活性作用物质基础研究提供依据。方法:将样品用盐酸水解后采用柱前衍生化-高效液相色谱法(HPLC法)测定15种氨基酸的种类与含量。结果:僵蚕提取物中含有所测的15种氨基酸残基,其总量为174.99g·L-1,其中谷氨酸Glu最高,其次为精氨酸Arg、丙氨酸Ala和甘氨酸Gly,而蛋氨酸Met含量最低。结论:该定量方法准确、可控,可用于僵蚕样品中氨基酸的分析。

合成水蛭素羧端肽段及其类似物的抗凝活性

水蛭素Ｃ端肽段为抗凝的活性部位〔１〕．为了进行构效关系的研究，构建Ｃ端肽段类似物的化学库，首先利用同步多中心合成技术合成了７种水蛭素Ｃ端类似物．经ＨＰＬＣ制备纯化，纯度在９６％以上．电喷雾质谱确认了合成肽的分子量．用新鲜人血浆，进行了凝血酶原激酶时间（ＡＰＴＴ）、凝血酶时间（ＴＴ）及凝血酶原时间（ＰＴ）测定．显示水蛭素羧端２０个氨基酸残基肽片是抗凝活性必需的基本骨架．其中应当包含封闭凝血酶催化位点和阴离子结合位点的特异结合序列以及保持两者间多功能性的连接桥．

低分子肝素相对分子质量与抗凝活性关系研究

目的:研究低分子肝素相对分子质量与抗凝活性之间的关系。方法:用生色底物法测定不同相对分子质量的低分子肝素6个分级和未分级样品的抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子效价,相对分子质量采用高效体积排阻色谱法(high performance size exclusion chromatography,HPSEC)测定。结果:抗Ⅹa因子与抗Ⅱa因子效价比随着相对分子质量的降低而增大。结论:在测定范围内,低分子肝素相对分子质量降低,抗凝活性降低,抗栓作用增强。

僵蚕抗凝活性部位中化学成分的初步研究

目的探索僵蚕水煎液、醇沉液和凝胶色谱馏分各部位中的抗凝活性成分。方法用水煎煮、60%醇沉处理和凝胶色谱方法制备抗凝活性部位,用化学反应鉴别、氮测定法、电导、紫外吸收光谱和高效液相色谱方法检测各部位中的蛋白质或多肽和氨基酸类及草酸铵等成分。结果僵蚕的水煎煮提取、醇沉和凝胶色谱分离所得抗凝活性部位中,多肽、氨基酸类和草酸铵都是其中的主要成分,其含量在80%以上。醇沉处理使草酸铵含量下降约52%,而多肽、氨基酸类含量仅降低约8%。凝胶色谱净化后,多肽、氨基酸类含量与水煎部位比约提高28%,与醇沉处理部位比约提高39%,而草酸铵含量与醇沉液部位相当,但比水煎煮部位降低约1倍。各部位的固形物中,15种氨基酸含量在40%～50%,占定氮法测定的蛋白质含量的60%～76%;多肽类成分的分子量为1.0～4.4kDa。结论本研究为僵蚕抗凝活性成分的进一步分离纯化提供了实验基础。

几种无机阳离子对全蝎抗凝活性的影响

目的研究全蝎中无机阳离子对全蝎抗凝活性的影响。方法以凝血酶时间为指标,分别在全蝎提取液中加入相应不同浓度的无机阳离子,考察其对全蝎抗凝活性的影响。结果加入无机阳离子后,明显缩短了全蝎的凝血酶时间(P<0.01)。结论铵离子等无机阳离子对全蝎提取液抗凝活性有明显的影响。

日本医蛭钴^(60)-γ射线辐照前后抗凝活性比较

水蛭为传统的常用动物药,始载于《神农本草经》,其后历代本草均有记载。现代研究表明,吸血蛭类分泌物含有多种广谱生物化学和药理活性物质,如抗凝血剂、抗血栓剂、麻醉剂、血管扩张剂等,其中主要的活性成分为水蛭素。但水蛭活性物质极不稳定,pH、温度、有机溶剂等均为影响其活性的因素。

导管室中应用达肝素时抗凝活性的监测

目的:本研究旨在探讨激活凝血时间(ACT)是否可作为达肝素在导管室中应用时有效的抗凝监测手段.方法:共人选108例患者,冠状动脉造影(CAG)术前5min一次静脉注射达肝素60IU/kg,术中不再追加抗凝药物.所有患者均在静脉注射达肝素后5min取血测量ACT.其中30例患者作为抗凝活性检测组分别在达肝素注射前和注射后6个时间点取血检测抗凝参数ACT、aPTT、抗Xa因子和抗IIa因子活性,观察静脉注射达肝素后的时间-抗凝效应关系.结果:静脉注射达肝素后5minACT值由基线121s升高到193s,10min时达峰值208s,并持续120min无明显下降(P<0.001).aPTT、血浆抗Xa和抗IIa因子活性也呈类似趋势.结论:ACT和aPTT对静脉注射达肝素敏感.ACT可以用来监测PCI期间静脉注射达肝素的抗凝活性.

地龙提取液的新型抗凝活性

用碱水解后再用乙醇分级分离,从地龙中获得抗凝血酶活性。该活性不能被AT—Ⅲ抗体及鱼精蛋白中和,表明其活性表达不依赖于AT—Ⅲ。活性提取液在216nm处有单一吸收峰,费林试验阴性,双缩脲试验阳性,提示该活性不属多糖或蛋白质,而可能是一种耐碱耐热的小肽或含双键化合物,与肝素及其类似物、水蛭素等抗凝物质不相同。