嵌合抗原受体基因修饰T细胞治疗胶质母细胞瘤的研究进展

胶质母细胞瘤(GBM)是成人最常见、最致命的原发性脑肿瘤。目前GBM的常规治疗包括手术、局部和全身化疗、放疗等,但治疗效果常不理想。嵌合抗原受体基因修饰T细胞(CAR-T细胞)治疗作为一种新的过继性免疫疗法,已经在血液肿瘤治疗中取得了较好的临床效果。CAR-T细胞可穿过血脑屏障,且不通过抗原呈递、不依赖主要组织相容性复合物即可识别预定义的肿瘤表面抗原。在GBM体外试验中,CAR-T细胞治疗的效果显著,但其临床应用仍存在诸多挑战。

抗原受体基因重排克隆性检测在淋巴瘤诊断中的应用

本研究旨在探讨抗原受体基因重排克隆性检测在淋巴瘤诊断中的意义。收集分析了31例淋巴瘤组织,石蜡包埋切片,HE染色后观察形态,免疫组织化学分析免疫表型。采用BIOMED-2标准化试剂盒检测抗原受体基因重排克隆性。结果表明,31例病例中形态学及免疫组织化学分析疑似T细胞淋巴瘤12例,T细胞反应性增生1例,B细胞淋巴瘤16例,B细胞反应性增生2例。基因重排克隆性检测免疫球蛋白(Ig)阳性率94.44%(17/18),T细胞抗原受体(TCR)阳性率92.31%(12/13),2例阴性。最终12例确诊为T细胞淋巴瘤,B细胞淋巴瘤17例,反应性增生2例,阳性检出率为93%。结论:抗原受体重排基因克隆性分析是诊断淋巴瘤的一种有效辅助手段。

嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞治疗肺癌的研究进展和挑战

近年来,免疫疗法尤其是单克隆抗体靶向药物越来越多地应用于肺癌的临床治疗,但仍有很多局限性。嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞(chimeric antigen receptor gene modified-T lymphocytes,CAR-T)疗法对于部分B细胞淋巴瘤和白血病的疗效显著,也为实体瘤的免疫治疗开辟了新途径。肺癌CAR-T疗法的热门靶点包括间皮素(MSLN)、黏蛋白突变体(TnMUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)和δ样配体3(DLL3)等,但相关临床研究均处于早期探索阶段。所面临的主要障碍包括脱靶毒性、肿瘤免疫抑制微环境和CAR-T细胞体内效能不足等。通过基因编辑改进CAR结构、设计多靶点CAR或组合应用多靶点CAR-T细胞、精细调控CAR-T细胞体内动态分布、改进给药方式或联合其他免疫治疗等策略可能有助于解决这些问题。

嵌合抗原受体基因修饰T细胞免疫疗法在肺癌治疗中的研究进展

肺癌是全世界所有癌症中发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一,目前仍缺乏较好的治疗手段。嵌合抗原受体基因修饰T(CAR-T)细胞免疫疗法作为一种新的治疗方法在血液系统恶性肿瘤中疗效显著,也为肺癌等实体肿瘤的免疫治疗开辟了新途径。然而,由于实体瘤的异质性、肿瘤微环境免疫抑制、肿瘤靶抗原逃逸及脱靶毒性等问题,造成CAR-T细胞免疫疗法在肺癌治疗中的应用存在挑战和障碍。本文总结了CAR-T细胞免疫疗在肺癌治疗中的最新研究进展,包括CAR-T细胞生物学特征、靶点选择、早期临床研究和治疗不良反应,并提出肺癌CAR-T细胞免疫疗法的优化策略,旨在为肺癌的临床免疫治疗提供新思路。

嵌合抗原受体基因修饰的T细胞免疫治疗骨肉瘤的研究进展

骨肉瘤(OS)是一种常见骨恶性肿瘤。常规治疗方式对患者预后生存率有一定改善,但对已转移患者的作用十分有限。靶向骨肉瘤相关抗原的嵌合抗原受体基因修饰的T细胞(CAR-T)疗法是一种很有前景的治疗方式。包括靶向HER-2、IL-11Rα、ROR1和GD2等骨肉瘤相关抗原的特异性CAR-T治疗在一些基础和临床研究中均有报道,且已经表现出了对骨肉瘤良好的治疗效果。

嵌合抗原受体基因修饰T细胞早期临床试验的探讨

目的对影响早期临床试验设计的因素进行探讨,并深入分析早期临床试验的设计原则和方法。方法从产品特征、临床前研究、安全性风险等方面分析CAR-T细胞临床试验的影响因素,并从试验目的、研究对象、试验设计等角度总结CAR-T细胞早期临床试验的考虑要点。结果 CAR-T细胞的产品特征、临床前研究方法和安全性风险与其它药物有显著差异,对早期临床试验有重要影响。结论在早期临床试验中探索CAR-T细胞的有效剂量、不良反应、初步的有效性非常重要,此外,还应在早期临床试验中验证CAR-T细胞的临床可及性及工艺稳定性。

抗原受体基因多样性产生机制的起源与演化

动物免疫系统根据其应答方式及存在形式的不同,可以分为天然免疫和适应性免疫.由于适应性免疫的关键器官/分子(比如胸腺//MHC)等只在有颌类脊椎动物中被发现,因此被认为是生命演化到高级阶段的体现,关于适应性免疫系统的起源一直是演化生物学和免疫学研究共同关注的重要问题.本文重点梳理了国内外学者近年来在抗原受体基因多样性产生机制及其演化等方面所取得的进展,尤其是在V(D)J重排机制的转座子起源及RAGL转座子的宿主驯化机制上.本文还总结了无颌类脊椎动物VLR受体及数个进化阶段特有的免疫多样性受体的研究进展.这些研究在完善经典免疫学理论的同时,也为医疗保健领域带来崭新的思路与技术.

MUC1嵌合抗原受体-基因工程NK细胞治疗难治/复发恶性实体肿瘤患者的护理

总结了MUC1 CAR-NK细胞治疗难治/复发恶性实体肿瘤患者临床效果与整体护理措施。12例难治/复发恶性实体肿瘤患者接受MUC1 CAR-NK细胞治疗,制定并实施相应的整套护理流程,着重加强对患者预处理的护理,细胞回输的护理,肿瘤溶解综合征(TLS)的观察与护理,同时采取心理护理等措施。12例难治/复发恶性实体肿瘤患者中,6例发热,其中短暂发热1例,发热伴畏寒寒颤5例;另外6例患者无明显症状,无严重不良反应。11例患者顺利出院,1例患者因疾病原因消化道大出血抢救无效死亡。通过对接受MUC1 CAR-NK细胞治疗的12例难治/复发恶性实体肿瘤患者的精心医治及整体护理,避免了TLS的发生,帮助患者克服了恐惧心理,特别是对其可能产生的各种并发症的系统护理,使MUC1 CAR-NK细胞治疗的风险降低到最小化,值得临床推广应用。

干扰TOX基因联合抗CD38 CAR-T细胞的构建及其对血液肿瘤细胞增殖和凋亡能力的影响

目的构建干扰胸腺细胞选择相关高迁移率群体盒(TOX)基因联合抗CD38 CAR-T细胞,观察其对血液肿瘤细胞增殖和凋亡能力的影响。方法采集健康志愿者外周血,分离单个核细胞(PBMC),提取原代T淋巴细胞。构建以shRNA技术靶向抑制TOX的抗CD38 CAR分子,分别命名为TOX-shRNA1-CD38 CAR和TOX-shRNA2-CD38 CAR,另设计一条不针对任何靶点的无意义RNA序列作为对照,命名为CD38 CAR分子。将分子酶切并连接逆病毒载体包装质粒pMFG,获得pMFG-TOX-shRNA1-MYC-CD38 CAR、pMFG-TOX-shRNA2-MYC-CD38 CAR和pMFG-MYC-CD38 CAR。将人原代T淋巴细胞分为CD38 TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组、CAR-T组,分别转导pMFG-TOX-shRNA1-MYC-CD38 CAR、pMFG-TOX-shRNA2-MYC-CD38 CAR和pMFG-MYCCD38 CAR质粒,获得CD38 CAR-T细胞、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T细胞和TOX-shRNA2-CD38 CAR-T细胞。采用RT-QPCR法检测三组细胞中TOX mRNA的相对表达量;记录三组细胞0~10 d体外培养生长倍数,观察细胞增殖能力。选取CD38高表达的人多发性骨髓瘤荧光素酶标记细胞RPMI-Luc、人Burkitt’s淋巴瘤荧光素酶标记细胞Raji-Luc作为靶细胞,与三组CAR-T细胞分别共培养48 h;另取三组CAR-T细胞单独培养作为对照,不加肿瘤细胞。采用流式细胞术检测三组CAR-T细胞表面CD69的表达效率,评价CAR-T细胞活化情况;对三组细胞进行CFSE染色,采用流式细胞术观察CAR-T细胞增殖能力;荧光素酶化学发光法观察CAR-T细胞在不同效靶比(1∶2、1∶4、1∶8)时对肿瘤细胞的杀伤效率;ELISA法检测三组CAR-T细胞上清中IFN-γ释放量;流式细胞术检测三组细胞表面PD-1表达量,评估CAR-T细胞的耗竭程度。结果 CD38 CAR-T组、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组、TOXshRNA2-CD38 CAR-T组的转导效率分别为41.51%、41.28%、44.84%,均超过40%。与CD38 CAR-T组比较,TOXshRNA2-CD38 CAR-T组TOX mRNA表达水平降低(P <0.05),TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组无明显变化(P>0.05)。三组CAR-T细胞体外培养0~10 d均稳定增殖,三组间生长倍数比较差异无统计学意义(P <0.05)。三组与肿瘤细胞共培养后,CD69表达效率均升高(P均<0.01)。与单独培养的CAR-T细胞相比,三组CAR-T细胞与Raji-Luc、RPMI-Luc细胞共培养后FITC信号左移,增殖加快,三组增殖能力比较无统计学差异(P> 0.05)。与CD38 CAR-T组相比,TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组在不同效靶比时对肿瘤细胞的杀伤效率均提高,γ干扰素释放水平升高,细胞表面PD-1表达水平降低(P <0.05或<0.01),而TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组与CD38 CAR-T组比较,肿瘤细胞的杀伤效率、γ干扰素释放水平、细胞表面PD-1表达水平均无统计学差异(P均>0.05)。结论成功构建了靶向抑制TOX基因联合抗CD38 CAR-T细胞,TOX-shRNA-CD38 CAR-T细胞能够有效抑制TOX表达;经肿瘤细胞激活后,其体外增殖活性及抗肿瘤能力显著增强,且TOX-shRNA-CD38 CAR-T细胞耗竭也得到改善。

急性粒细胞白血病TCRγ基因重排的检测及其意义

①目的 探讨急性粒细胞白血病 (AML)中T细胞抗原受体γ链 (TCRγ)基因重排的发生情况及其与AML临床特征的关系。②方法 以构建的TCRγ基因片断为内参照模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)法扩增TCRγ基因重排片断。③结果 TCRγ基因重排在AML中发生率为 2 4 .4 % ,在急性单核系白血病中发生率高达 4 8.1% ,差异有极显著性 (χ2 =12 .32 ,P <0 .0 0 1)。有TCRγ基因重排的AML病人的外周血白细胞计数高于无TCRγ基因重排的AML病人 (t=2 .5 35 ,P <0 .0 5 ) ;有TCRγ基因重排的AML病人的肝大程度大于无TCRγ基因重排的AML病人 (t=2 .35 7,P <0 .0 5 ) ;TCRγ基因重排阳性的AML病人达到第 1次缓解的时间长于TCRγ基因重排阴性的AML病人 (t=2 .5 32 ,P <0 .0 5 )。④结论 TCRγ基因重排可发生于部分髓系白血病病人 ,急性单核系白血病的发生率最高 ,这部分病人临床体征明显 ,对标准化疗不敏感 ,不易获得缓解。

IL-21和CCL19修饰可提高NKP30 CAR-T细胞对肺癌的杀伤效率并促进其肿瘤浸润

目的探讨细胞因子IL-21和趋化因子CCL19修饰的NKP30 CAR-T细胞是否增强对肺癌的杀伤和浸润作用。方法在NKP30 CAR基础上融合基因IL-21和CCL19构建IL-21-CCL19 NKP30 CAR;CAR-T细胞的培养使用CD3CD28单抗及细胞因子IL-2刺激;流式细胞术检测免疫细胞表型;迁移实验检测IL-21对免疫细胞的迁移作用;乳酸脱氢酶(LDH)及成球实验检测CAR-T细胞的杀伤及浸润能力;酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测IFN-γ的分泌数量;ELISA检测IL-21及CCL19的分泌情况;体内实验中,将肿瘤细胞显微注射到斑马鱼卵黄囊,构建斑马鱼移植瘤模型,24 h后将免疫细胞注射至同样部位,体式荧光显微镜拍摄荧光。结果NKP30配体(B7H6)在正常组织及血液细胞不表达,在肺癌细胞上高表达(90%以上)。IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞与NKP30 CAR-T细胞和常规T细胞相比,具有更强的增殖能力、迁移能力及中心记忆T细胞的形成(P<0.001),免疫抑制分子CTLA4与PD1显著降低(P<0.005),对肺癌细胞具有更强的杀伤能力(P<0.001),伴随IFN-γ数量明显增加(P<0.001)。IL-21-CCL19 CAR-T细胞杀伤肺癌细胞中产生大量细胞因子IL‑21(3152.33±526.74 pg/mL)和趋化因子CCL19(1853±211.95 pg/mL)。体内实验中,CAR-T细胞和普通T细胞比较,具有较强的杀伤能力和增殖能力,但2种CAR-T细胞无明显差异(P>0.05)。结论IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞更容易浸润到肿瘤内部,有效杀伤肿瘤细胞,同时产生更多的记忆T细胞。

多发性硬化患者外周血T淋巴细胞受体β链可变区多态性研究

目的探讨多发性硬化(MS)不同阶段外周血T淋巴细胞受体β链可变区(TCRVβ)多态性的特点。方法收集首都医科大学宣武医院神经内科临床孤立综合征(CIS)患者30例、复发-缓解型多发性硬化(RRMS)患者40例、继发-进展型多发性硬化(SPMS)患者10例、健康对照者30名,经TCRVβ单克隆抗体标记后采用流式细胞仪分析各组外周血TCRVβ扩增程度以及TCRVβ24个亚家族扩增患者百分比、扩增片段所占百分比的差异。结果 CIS、RRMS及SPMS组TCRVβ存在扩增患者比例、扩增个数和扩增分数均高于对照组(P<0.01),而CIS、RRMS及SPMS组间比较无统计学差异(P>0.05)。CIS、RRMS及SPMS组CD4+TCRVβ2扩增频率均高于对照组(P<0.008),CIS组、RRMS及SPMS组CD8+TCRVβ11表达水平均低于对照组(P<0.05),SPMS组CD4+TCRVβ21.3表达水平低于CIS组(P<0.05)。ROC曲线分析提示CD8+TCRVβ11的扩增片段所占百分比对MS诊断具有一定价值,对MS分型无诊断价值;CD4+TCRVβ21.3的扩增片段所占百分比对SPMS诊断具有一定价值。结论可通过检测部分TCRVβ片段对MS及SPMS的早期诊断提供相关依据。

抗EGFRvⅢCAR-T疗法联合Notch1通路抑制剂对人胶质瘤起始细胞自我更新能力的抑制作用

目的观察抗表皮生长因子受体vⅢ嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞(抗EGFRvⅢCAR-T)疗法联合Notch1通路抑制剂DAPT对人胶质瘤起始细胞(GICs)自我更新能力的抑制作用。方法将胶质母细胞瘤原代细胞分为DT007和DT008两部分,经干细胞成球培养后采用免疫磁珠法分选,Western blotting法及免疫荧光法鉴定为GICs,分别命名为PA37S和PA38S。取PA37S、PA38S两种细胞,每种细胞随机分为对照组(加入细胞培养液)、DAPT组(加入10µmol/L DAPT)、CAR-T组(加入慢病毒转染获得的抑制EGFRvⅢ表达的抗EGFRvⅢCAR-T淋巴细胞)、CAR-T+DAPT组(加入抗EGFRvⅢCAR-T淋巴细胞和10µmol/L DAPT),均培养24 h。采用Western blotting法检测细胞EGFRvⅢ、Notch1活化相关指标Hes1蛋白相对表达量,成球实验检测细胞球直径和数目,极限稀释实验检测5、10、20、50、100、200、500个/孔细胞密度下的细胞球数目。结果在PA37S、PA38S细胞中,CAR-T组、CAR-T+DAPT组EGFRvⅢ蛋白相对表达量均低于对照组、DAPT组,DAPT组、CAR-T+DAPT组Hes1蛋白相对表达量均低于对照组、CAR-T组(P均<0.05)。成球实验结果显示,在PA37S、PA38S细胞中,DAPT组、CAR-T组、CAR-T+DAPT组细胞球数量和直径均低于对照组,以CAR-T+DAPT组降低更明显(P均<0.05)。极限稀释实验结果显示,在PA37S细胞和PA38S细胞中,5、10个/孔细胞密度下各组细胞球数量比较差异均无统计学意义(P均>0.05);20个/孔细胞密度下CAR-T+DAPT组细胞球数量低于对照组,50、100、200个/孔细胞密度下CAR-T+DAPT组细胞球数量均低于对照组、DAPT组、CAR-T组,500个/孔细胞密度下DAPT组、CAR-T组、CAR-T+DAPT组细胞球数量均低于对照组且CAR-T+DAPT组降低更明显(P均<0.05)。结论抗EGFRvⅢCAR-T疗法联合DAPT可抑制GICs的自我更新能力。

T细胞抗原受体（TCR）标志物βF1及TCRγ在T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病中的表达

摘要目的检测T细胞抗原受体（TCR）标志物βF1及TCRγ在T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病（T－LBL/ALL）中的表达情况，并探讨其临床病理特征。方法收集2010至2016年广东省人民医院病理科51例确诊为T－LBL/ALL的病例，采用免疫组织化学EnVision法，检测βF1及TCRγ在T－LBL/ALL表达情况并进行统计学分析。结果51例T－LBL/ALL中儿童及青少年患者13例，成人患者38例。βF1及TCRγ在T－LBL/ALL的表达率分别为27.5%（14/51）及15.7%（8/51）。成人患者（≥18岁）在αβ T－LBL/ALL、TCR沉默型T－LBL/ALL及γδ T－LBL/ALL占比分别为7/14、79.3%（23/29）及8/8，其差异具有统计学意义（P＝0.023）。而性别、乳酸脱氢酶值、骨髓侵犯及临床分期在3组中差异均无统计学意义（P〉0.05）。8例γδ T－LBL/ALL中6例为CD4^－/CD8^－表型，14例αβ T－LBL/ALL中7例为CD4^＋/CD8^＋表型。CD4/CD8表达情况在3组中差异有统计学意义（P〈0.01）。结论γδ T－LBL/ALL仅发生于成人患者，以CD4^－/CD8^－表型为主；αβ T－LBL/ALL各年龄阶段均可发生，儿童及青少年患者发生率更高，以CD4^＋/CD8^＋表型最多见。

儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病检测及其进展

治疗的强度应与白血病复发的风险相适应是当代医学对于儿童急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukaemia，ALL）治疗的基本观念。

CAR-T细胞治疗实体瘤临床转化的研究进展

T细胞能够识别肿瘤抗原并特异性杀伤癌变细胞,是杀伤肿瘤的主要执行细胞,也是临床上研究最多的肿瘤治疗性免疫细胞。嵌合抗原受体基因修饰T(chimeric antigen receptor gene-modified T,CAR-T)细胞治疗能够绕过抗原提呈和MHC的限制,已在B急性淋巴细胞白血病(B-acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)治疗中取得显著效果。近年来,越来越多的研究结果表明,CAR-T细胞同样可以用于实体瘤的治疗,如黑色素瘤、神经胶质瘤、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌及其他常见实体瘤(转移性乳腺癌、胰腺癌)等。本文将对近年来CAR-T细胞免疫疗法在实体瘤临床转化的研究进展作一综述,主要从免疫抑制肿瘤微环境、脱靶毒性与细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)、肿瘤的异质性三个方面阐述CAR-T细胞治疗实体瘤的瓶颈,并对未来的发展加以展望。

CAR-T细胞在肿瘤治疗中的机遇与挑战

近年来,嵌合抗原受体基因修饰T(CAR-T)细胞作为"活的药物"在血液肿瘤治疗中取得了令人振奋的效果,成为肿瘤治疗新的发展方向,得到了医学界广泛的认可。纵观免疫细胞治疗技术的发展历程,任何一项新的治疗手段从实验室到临床应用都需要一个不断完善的过程,CAR-T细胞治疗技术同样如此。虽然它在血液系统恶性肿瘤的治疗中显示出前所未有的疗效,如对晚期复发难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的完全缓解(CR)可达到90%,对慢性淋巴细胞白血病(CLL)和部分B细胞淋巴瘤的CR达到50%以上,但目前CAR-T细胞疗法在血液肿瘤的治疗过程中尚存在脱靶效应、毒副作用、体内持续时间短、复发率高等问题;在CAR-T细胞治疗实体瘤方面,其安全性和有效性已得到证实,但疗效还有待提高。针对上述问题,笔者总结出提高CAR-T细胞治疗效果的六大策略:(1)克服患者本身T细胞的缺陷;(2)选择CAR-T细胞的最佳培养条件;(3)制定靶细胞刺激的最佳方案;(4)确定化疗预处理的方案;(5)实现CAR的人源化;(6)加强共刺激信号的组合。本文对近年来CAR-T细胞治疗技术的研究进展及该领域中亟需解决的问题作一分析与展望。