新型冠状病毒疫苗受体结合域抗原含量检测方法建立

目的建立通用的新型冠状病毒疫苗(简称新冠疫苗)受体结合域(RBD)抗原含量检测方法。方法以新冠病毒刺突蛋白(S蛋白)RBD的重组抗体为标准品,先将疫苗中的蛋白解吸附,采用酶联免疫吸附试验检测疫苗中的RBD蛋白含量,并验证方法的线性、定量下限、准确度、精密度和稀释可靠性,同时对部分上市新冠疫苗进行检测。结果3次试验标准曲线的决定系数(R2)分别为0.9966,0.9958,0.9975(n=6);定量下限为7.81 pg/mL;批内和批间准确度均值为质控标示值的91.98%~110.16%(精密度试验)和93.68%~101.01%(稀释可靠性试验),X,Y,Z公司的加样回收率分别为86.81%,82.97%,105.41%,测定值的变异系数均小于10%。X,Y,Z公司新冠疫苗中RBD蛋白的平均含量分别为302.96 pg/mL、1010.80 pg/mL、42.92μg/mL。结论该方法的方法学验证指标均符合2020年版《中国药典(四部)》通则9012指导原则相关要求,可用于多种技术路线新冠疫苗的RBD抗原含量检测。

检测狂犬病疫苗抗原含量的竞争ELISA的建立及初步应用

为满足狂犬病疫苗生产质量控制的需要,建立了竞争ELISA检测法,通过标准曲线的确定来计算病毒抗原的相对含量,并与ELISA间接法和双抗体夹心法结果进行比较。该方法方便准确,可对培养中的病毒抗原相对含量进行全程监测,是一种有效的辅助检测手段。

C型产气荚膜梭菌类毒素在家兔和绵羊上抗原含量与免疫效果关系的研究

为了确定C型产气荚膜梭菌类毒素抗原含量与免疫效果之间的关系,试验以不同剂量的类毒素分别接种家兔和绵羊,免疫18 d后测定血清中和效价,并用1个最小致死量(MLD)的毒素进行攻毒。结果表明:1个家兔MLD的毒素含量为小鼠MLD的20倍,1个绵羊MLD的毒素含量为小鼠MLD的450倍;类毒素含量与免疫效果在一定范围内呈正相关,在家兔和绵羊上能提供保护的最小免疫剂量分别为400个小鼠MLD和500个小鼠MLD的类毒素。

DF-1细胞替代CEF细胞测定IBDV液抗原含量和血清中和抗体效价的研究

为了探讨DF-1细胞替代鸡胚成纤维(chicken embryo fibroblast,CEF)细胞作为培养基质用于测定鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)液抗原含量及血清中和抗体效价的可行性,试验以DF-1细胞和CEF细胞作为培养基质测定了6批次IBDV BJQ902株病毒液抗原含量和用不同剂量ND、IB、IBD三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+BJQ902株)免疫SPF鸡血清和未免疫SPF鸡血清的中和抗体效价。结果表明:6批次病毒液病毒含量为1×10^(7.7)~1×10^(8.1)TCID50/0.1 mL,两种细胞对同一批次病毒样品的测定结果一致,重复测定无差异;IBDV阳性血清样品中和抗体效价为8~17 lb,两种细胞对同一血清样品中和抗体效价的检测结果无差异。说明DF-1细胞可以替代CEF细胞作为培养基质,用于IBDV液抗原含量及血清中和抗体效价的测定。

慢性乙性肝炎患者血清HBV DNA与e抗原含量的关系

目的探讨慢性乙性肝炎患者血清HBV DNA与e抗原含量的关系。方法 2010年4月至2011年4月诊治的慢性乙性肝炎198例,进行HBV DNA定量并与HBeAg定量、HBsAg定量进行观察。结果 HBV DNA定量HBV DNA≥107copies/ml时HBeAg定量(1.0616±1.3656)NCU/ml;107>HBV DNA≥105时HBeAg定量(0.2892±0.5854)NCU/ml。结论 HBV DNA定量与HBeAg定量呈正相关性。

从不同猪瘟商品化疫苗抗原含量检测分析猪瘟的综合防控

猪瘟目前仍是严重危害我国养猪业的重要传染病,给养猪业造成巨大的经济损失。近年来我国猪瘟的流行特点发生了较大变化,以前典型猪瘟频发的大流行状况已得到控制,非典型猪瘟或温和型猪瘟逐渐占据主导地位,周期性、波浪式的地区散发性流行日益严重。猪瘟一旦发生,基本无药可治,唯有接种疫苗,使猪体产生较强的免疫力,方可抵御猪瘟病毒的侵害。

应用ELISA与PCR方法测定猪瘟弱毒疫苗中的抗原含量

本试验通过应用猪瘟抗原/血清ELISA试剂盒(IDEXX HerdCheek Co.)和PCR方法对已知滴度的2份成品疫苗进行抗原含量测定,血清ELISA检测结果表明2份疫苗抗原检出滴度为32∶1、64∶1,检测敏感性可达1头份/瓶。PCR的检测结果表明50头份疫苗稀释64倍20头份疫苗稀释32倍还可检出CSFV抗原,与ELISA检测敏感性相似。试验结果证明:猪瘟抗原/血清ELISA试剂盒与PCR方法能够稳定、快速、简单地用于CSFV病毒含量测定,为疫苗生产的质量控制提供了一种可靠和稳定的方法。

慢性乙型肝炎患者血清HBV-DNA与e抗原含量的关系

目的:探讨慢性乙型肝炎患者血清脱氧核糖核酸(HBV-DNA)与e抗原含量(HBeAg)的关系。方法:在医院2015年5月至2016年2月期间诊治的慢性乙型肝炎患者中抽取72例作为研究对象,应用定量聚合酶链反应法、Abbott微粒子酶免疫荧光法对本组患者HBV-DNA、e抗原含量进行检测,并分析HBV DNA、e抗原含量之间的关系。结果:1)HBeAg(+)者、HBeAg(-)者和e系统双阳者之间HBeAg水平、HBV-DNA水平两两对比均存在统计学差异(均P<0.01),HBV-DNA与HBeAg之间存在一定相关性,e抗原转阴并不能准确反应病毒复制是否停止;2)轻度慢性乙肝患者的血清HBV-DNA水平最高,其余依次是重度患者、中度患者,其两两对比有统计学差异(P<0.01或P<0.05)。结论:慢性乙型肝炎患者血清HBV-DNA与e抗原含量的关系密切,慢性乙型肝炎患者病情越重,其HBV-DNA水平越低,其病变程度与患者的病毒量呈现负相关关系。

神经元特异性烯醇化酶癌胚抗原含量及其比值的测定在小细胞肺癌诊断中的意义

近年来，肺癌的发病率与病死率逐年上升，严重危害人类的健康和生命，一般肺癌首诊时已达中晚期。肺癌的早期诊断显得尤为重要。肺癌相关性肿瘤标志物的测定是一种非侵袭性的检查方法，简便易行。因此，肿瘤标志物的研究与应用为肺癌的早期发现与诊断开辟了新的领域。本研究探讨肿瘤标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）、癌胚抗原（CEA ）含量及其比值的测定在小细胞肺癌（SCLC）诊断中的临床意义。

人凝血因子Ⅷ抗原含量ELISA检测方法的建立、验证及应用

目的双抗体夹心法测定标本中人凝血因子Ⅷ(human coagulation factor Ⅷ, FⅧ)抗原水平并进行验证和应用。方法建立检测人FⅧ抗原(FⅧ∶Ag)含量的双抗体夹心ELISA法;用人FⅧ/VWF标准血浆(NIBSC 07/316)标定内控标准品(S.A.R.P);根据方法学验证的要求对此方法进行线性、准确度、精密度、样品稳定性的研究分析。将验证后的该方法用于FⅧ纯化工艺的监控及产品质量分析。结果以NIBSC 07/316标定分装冻存的S.A.R.P的FⅧ∶Ag为1.12 Ag/mL,标准曲线的线性范围为(0.003—0.112)Ag/mL,各浓度回收率在97.62%—102.19%,CV<5%,R^2≥0.99;不同浓度样品检测结果的批内准确度在90.70%—95.23%,批间准确度在91.50%—94.20%;批内精密度CV值在1.69%—4.98%,批间精密度CV值在2.63%—4.83%。样品添加实验的回收率在87.50%—89.50%,特异性回收率在94.64%—101.78%。具有生物学活性的样品应-80℃冻存,复融1次后立即检测。武汉血制公司FⅧ纯化工艺中聚乙二醇4000(PEG 4000)沉淀和离子交换层析去除了大约60%的FⅧ抗原,工艺稳定性较好,生产规模可线性放大,不同来源产品FⅧ∶C/FⅧ∶Ag的比值接近。结论本方法具有良好的线性、准确度和精密度。用该方法进行FⅧ抗原含量检测可作为FⅧ纯化工艺内部质量控制的一个指标。

不同抗原含量的口蹄疫三价灭活疫苗对犊牛机体抗体产生的影响

为了探究犊牛免疫口蹄疫三价灭活疫苗后抗体效价的变化规律,以及免疫不同抗原含量的口蹄疫三价灭活疫苗与犊牛机体产生的抗体效价水平的关系,试验选择30头新生犊牛连续检测母源抗体水平,母源抗体消失后,将30头犊牛分为A、B、C三组,分别使用抗原含量为4μg/mL、4μg/mL和6μg/mL的口蹄疫三价灭活疫苗各2 mL进行分组免疫;首次免疫21 d后,A、B、C三组分别使用抗原含量为4μg/mL、6μg/mL和6μg/mL的口蹄疫三价灭活疫苗各2 mL进行加强免疫。分别于首次免疫7,14,21,28,35,42,49,60,90,120天通过尾静脉采血,分离血清,采用液相阻断ELISA法对采集的犊牛血清进行口蹄疫O、A和AsiaⅠ型抗体效价检测。结果表明：3日龄犊牛母源O、A和AsiaⅠ型抗体效价平均值均大于1∶128,7日龄达到峰值,随着时间推移,呈现下降趋势,在90日龄降低到最低;首次免疫后第21天,A、B、C各组抗体效价平均水平相同,均为1∶128;加强免疫后7天,A组O、A和AsiaⅠ型抗体效价平均值均为1∶128,B、C组O、A和AsiaⅠ型抗体效价平均值为1∶256;A组抗体效价平均值于加强免疫后28天达到最高（O型和A型抗体为1∶512,AsiaⅠ型抗体为1∶362）,而B、C两组抗体效价平均值则于加强免疫后14天达到最高（O、A和AsiaⅠ型抗体均为1∶512）,抗体效价水平与青年牛相当。可见口蹄疫疫苗的首次免疫时间为90日龄时,母源抗体对疫苗免疫的影响最小;首次免疫时,疫苗中抗原含量对犊牛抗体效价的影响很小;二次免疫时增加抗原含量有助于快速提升犊牛体内的抗体效价,对抗体效价峰值的出现时间有着重要影响。

不同抗原含量鸡减蛋综合征灭活疫苗的HI效价测定

为优化鸡减蛋综合征相关多联灭活疫苗的生产工艺,利用Pellicon切向流超滤系统,将制备的鸡减蛋综合征病毒液6.5倍浓缩,0.1%(V/V)甲醛灭活。将抗原液用灭菌生理盐水进行1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256稀释,按照常规生产工艺规程分别制备灭活疫苗,免疫21日龄SPF雏鸡。21d后翅静脉采血,HI试验检测免疫鸡的抗体水平。结果显示,免疫鸡HI抗体效价几何平均值均不低于7.0log2,符合鸡减蛋综合征灭活疫苗质量标准要求。

蛋白质免疫印迹快速测定猪肺炎支原体抗原含量

为建立快速测定猪肺炎支原体抗原含量的方法,试验应用P46单抗建立不同CCU含量的猪肺炎支原体抗原蛋白免疫印迹图谱,测定不同批次的猪肺炎支原体抗原CCU含量,并与Western blot(WB)测定的CCU进行比较。结果显示:曝光5 s,107 CCU/mL含量以上的猪肺炎支原体抗原在46 kDa处有条带,且条带粗细、明暗程度随着CCU含量的增高而增强;中试生产的7批抗原中,有3批抗原CCU和WB 2种方法测定的含量相同,两批抗原测定的含量基本相同;两批抗原测定的含量有差异,但差值在1.5~5.0倍之间。结果表明,WB可用于猪肺炎支原体抗原含量的快速测定。

不同抗原含量鸡新城疫灭活疫苗的HI效价测定

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种禽类急性、高度接触性传染病，导致鸡群生产性能下降和大批死亡，造成巨大的经济损失。

随意提高疫苗的抗原含量易导致免疫失败

2005年以前，我国猪瘟免化细胞弱毒疫苗的抗原效价为150RIU/头份，养猪生产中按照技术规范操作，接种1头份/头次猪瘟疫苗根本不能形成有效保护，迫使基层兽医，防疫员和养猪户加大免疫剂量，出现了免疫接种5头份/头次，10头份/头次甚至更多的现象。

不同抗原含量鸡减蛋综合征灭活疫苗的HI效价测定

为优化鸡减蛋综合征相关多联灭活疫苗的生产工艺，利用Pellicon切向流超滤系统，将制备的鸡减蛋综合征病毒液6．5倍浓缩，0．1％（V／V）甲醛灭活。将抗原液用灭菌生理盐水进行1：8、1：16、1：32、l：64、1：128、1：256稀释，按照常规生产工艺规程分别制备灭活疫苗，免疫21日龄SPF雏鸡。21d后翅静脉采血，HI试验检测免疫鸡的抗体水平。结果显示，免疫鸡HI抗体效价几何平均值均不低于7．0log2，符合鸡减蛋综合征灭活疫苗质量标准要求。

重组SARS-CoV-2蛋白疫苗抗原含量通用检测试剂盒的研制

目的制备重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)蛋白疫苗抗原含量通用检测试剂盒,并进行验证。方法选用中国食品药品检定研究院(简称中检院)制备的羊抗S蛋白多克隆抗体作为包被抗体,从4株单克隆抗体(14C8、15F9、17A7和20D8)中筛选出1株具有受体结合域(receptor-binding domain,RBD)结合活性高,且广谱抗主要突变株的单克隆抗体作为酶标抗体(用HRP标记),制备重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的双抗体夹心ELISA法通用检测试剂盒,并采用棋盘滴定法对包被抗体稀释度(1∶125~1∶4000)和酶标抗体稀释度(1∶250~1∶32000)进行优化。验证试剂盒的专属性、线性范围、准确性、精密性及耐用性。将制备的通用检测试剂盒分发给12个实验室,检测各实验室自制的不同表达系统(CHO细胞、毕赤酵母、Sf9细胞或大肠埃希菌)和目的蛋白(RBD或S蛋白)的15批重组SARS-CoV-2蛋白疫苗原液(包括11批以WT株为参考序列设计的原液及4批以Beta、Gamma和Delta变异株设计的原液)。结果确定包被抗体最佳稀释度为1∶500,单克隆抗体20D8作为酶标抗体,最佳稀释度为1∶4000。通用检测试剂盒与严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome,MERS)病毒的重组S蛋白无交叉反应;第1代重组SARS-CoV-2蛋白疫苗抗原国家标准品(简称国家标准品)浓度在0.16~2.50 U/mL范围内,与A450/630呈良好的线性关系,线性方程为:y=0.791 x-0.1004,R2=0.9937;0.16~2.50 U/mL国家标准品重复6次检测结果回收率均在95%~104%之间,变异系数(coefficient of variation,CV)均<15%;2名实验员在不同时间重复3次检测结果的CV为4.4%~6.6%;在不同温度及时间条件下检测结果回收率均在80%~120%范围内。15批重组SARS-CoV-2蛋白疫苗原液抗原含量的检测结果与国家标准品均具有良好的平行性。结论本研究建立的抗原含量通用检测试剂盒具有良好的专属性、准确性、精密性及耐用性,可用于重组SARSCoV-2蛋白疫苗抗原含量的检测。