时间分辨荧光分析法测定抗原培养滤液蛋白10对结核性胸腔积液诊断的临床研究

目的探讨时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)测定抗原培养滤液蛋白10(CFP10)对于早期诊断结核性胸腔积液的临床价值。方法选择106例结核性胸腔积液病例与40例非结核性胸腔积液病例的胸腔积液标本。建立TRFIA法检测胸腔积液中CFP10抗原,并与酶联免疫吸附法(ELISA)的检测结果比较。结果 TRFIA法对CFP10抗原的平均回收率为96.87%,标准曲线相关系数r2=0.998,平均批内变异系数(CV)与批间CV分别为2.98%及4.20%,TRFIA法检测观察组CFP10的Log浓度为(1.924±0.57)μg·L^(-1),对照组为(0.108±0.03)μg·L^(-1),两组比较差异有统计学意义(t=24.72,P<0.01)。观察组ROC曲线的AUC=0.923。取临界值为11.86μg·L^(-1)时,灵敏度与特异度分别为95.28%与92.50%,均高于ELISA法。结论 TRFIA法测定结核性胸腔积液中CFP10蛋白具有很高的灵敏度与特异度,有利于早期诊断结核性胸腔积液。

用于时间分辨荧光免疫分析的结核分枝杆菌培养滤液蛋白10参照品的制备

目的通过基因工程技术制备结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP10)、链亲和素(SA)/CFP10融合蛋白(包括SA-CFP10、CFP10-SA),筛选灵敏度最高、稳定性最好者作为时间分辨荧光免疫分析法检测(TRFIA)的参考标准品。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组为模板,扩增CFP10基因,将其克隆到pET24b、pET24b-SA、pET21a-SA三种载体中,转化到大肠杆菌Rosetta中进行表达,表达产物经镍离子亲和层析(Ni-NTA)柱纯化,透析法复性。三种重组蛋白用双抗体夹心法TRFIA从灵敏度、稳定性两方面进行评价。结果成功构建了pET24b-CFP10、pET24b-SA-CFP10和pET21a-CFP10-SA三种表达载体,重组蛋白CFP10主要为可溶形式表达,融合蛋白CFP10-SA、SA-CFP10均以包涵体形式存在,Ni-NTA柱纯化后透析复性,纯度均可达90%以上。三种重组蛋白经双抗体夹心TRFIA,CFP10-SA灵敏度最高(0.02μg/L),稳定性最好。结论得到了灵敏度高、稳定性好的TRFIA检测CFP10的参照品CFP10-SA融合蛋白,为研制该结核分支杆菌时间分辨荧光诊断试剂盒,并应用于临床打下了基础。

培养滤液蛋白10/靶6000蛋白检测对结核性脑、胸膜炎早期诊断的临床研究

目的探讨靶6000蛋白(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)在早期辅助诊断结核性脑、胸膜炎中的价值。方法将收集的29例阳性病例(结核性脑膜炎及胸膜炎的患者)和30例对照病例应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测其脑脊液或胸水ESAT-6和CFP-10蛋白,并与用聚丙烯酰胺凝胶块浓缩脑脊液或胸水后检测ESAT-6和CFP-10蛋白浓度进行比较。结果浓缩前的标本:CFP-10的灵敏度为62.1%,特异度为86.7%;ESAT-6的灵敏度为68.9%,特异度为90%;两蛋白联合诊断的灵敏度为79.3%,特异度为96.7%。浓缩后的标本:CFP-10的灵敏度为68.9%,特异度为86.7%;ESAT-6的灵敏度为72.4%,特异度为90%;两蛋白联合诊断的灵敏度为89.6%,特异度为96.7%。浓缩前后病例组与对照组的CFP-10和ESAT-6蛋白的阳性率差异均有统计学意义(均<0.05)。结论 ESAT-6和CFP-10检测结核具有较高的灵敏度和特异度,且简便和廉价,适合用于早期辅助诊断。

Dot-ELISA法检测结核分枝杆菌特异性抗原CFP10的改进和建立

目的建立一种检测结核分枝杆菌特异性抗原培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10,CFP10)的斑点酶联免疫吸附试验(dot enzyme linked i mmunesorbant assay,Dot-ELISA)方法。方法采用真空泵抽吸浓缩检测样本,改进Dot-ELISA用改进前的和改进后的Dot-ELISA方法检测同一批临床确诊的结核性胸膜炎的胸腔积液25例和非结核性胸腔积液31例,比较方法改进前后检测CFP10的敏感性和特异性;改变实验程序中的工作条件(硝酸纤维素膜的孔径、滴加样本的体积、真空泵抽吸的压力、不同的封闭液、温育的温度和时间及抗体的滴度),确定最适工作条件及重复性和稳定性。结果改进前检测CFP10的敏感性为76.0%,改进后并应用最适条件的敏感性为96.0%,差异有统计学意义(P=0.042);特异性和重复性、稳定性实验结果表明,所建立的Dot-ELISA法特异性和改进前差异无统计学意义(P=0.641),且稳定性和重复性较好。结论所建立的Dot-ELISA是一种比较敏感、特异和稳定的检测方法,能用于结核特异性抗原的检测和疾病的诊断。

小鼠巨噬细胞内表达结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白对细胞增殖和凋亡的影响

目的:建立培养滤液蛋白10-早期分泌性抗原靶6(CFP10-ESAT6)真核表达质粒并转染RAW264.7巨噬细胞,观察胞内表达CFP10-ESAT6对细胞活性及凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法:将CFP10-ESAT6融合基因插入真核表达质粒pEGFP-N1,构建重组质粒,转染RAW264.7巨噬细胞。采用MTT的方法测定CFP10-ESAT6融合蛋白对RAW264.7巨噬细胞活性的影响,采用结核分枝杆菌19 kD脂蛋白和十字孢碱(staurosporine)处理RAW264.7巨噬细胞,并以流式细胞术检测细胞凋亡率以及Toll样受体2(TLR2)的表达。结果:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6并转染至RAW264.7巨噬细胞;与对照组相比,胞内表达CFP10-ESAT6不能影响巨噬细胞的活性,但可以明显抑制结核分枝杆菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡(P<0.05),并显著抑制了TLR2的表达(P<0.05)。结论:巨噬细胞内表达的CFP10-ESAT6融合蛋白不具有细胞毒性作用,但可以通过下调TLR2的表达来抑制结核分枝杆菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡。

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白免疫小鼠效果初步评价

目的融合表达和纯化结核分枝杆菌(MTB)CFP10-ESAT6(CE),初步评价免疫效果。方法构建pET32a(+)-CE重组质粒,E.coli BL21(DE3)中融合表达,Ni-NTA层析纯化。用CE加铝佐剂,50μg CE/只/次,分3次免疫BALB/c小鼠。ELISA测定血清IgG抗体;ELISpot与Luminex检测细胞因子,进行MTB体外生长抑制试验。卡介苗(BCG)为阳性对照。结果CE免疫小鼠,能诱导产生高效价的IgG、IgG1和IgG2a,且IgG1(t=19.1,P<0.0001)和IgG2a(t=8.7,P<0.0001)抗体水平均高于BCG组。CE组与BCG组诱导产生的分泌IFN-γ的斑点形成细胞(SFC)数量差异无统计学意义(t=0.4,P>0.05),但诱导分泌IL-4的SFC数量高于BCG组(t=8.0,P<0.0001)。CE组诱导分泌GM-CSF(t=8.4,P<0.05)、IL-6(t=8.3,P<0.05)、IL-10(t=2.5,P<0.05)和IL-4(t=7.0,P<0.05)均高于BCG组,而CE组诱导分泌IFN-γ(t=1.4,P>0.05)、TNF-α(t=1.8,P>0.05)、IL-2(t=2.0,P>0.05)、IL-12(t=0.9,P>0.05)和IL-17(t=1.3,P>0.05)均与BCG组相似,差异无统计学意义。CE组小鼠脾细胞的MTB体外生长抑制结果与BCG组相似(t=0.8,P>0.05)。结论CE免疫小鼠可诱导较强的Th1与Th2混合型免疫反应,且有较强的体外抑制MTB生长的能力,表明CE具有良好的结核疫苗研制应用价值。

CFP10蛋白时间分辨荧光免疫分析法在结核性胸腔积液中的诊断价值

目的 对基于时间分辨荧光免疫分析技术(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)诊断结核性胸腔积液的新方法进行临床评价。方法 共收集191例疑似结核性胸腔积液标本。采用TRFIA检测胸腔积液标本中结核分枝杆菌培养滤液蛋白-10(CFP10),并与培养、涂片及T.SPOT.TB进行比较。结果 有效检测标本174例,其中100例临床综合诊断为结核性胸腔积液,74例诊断为非结核性胸腔积液。以临床综合诊断为金标准,CFP10蛋白时间分辨荧光免疫分析法(CFP10-TRFIA)检测结核性胸腔积液患者的敏感度为42%(42/100)高于细菌学方法(P<0.05),特异性为90.5%(67/74)优于T.SPOT.TB(P<0.05),阳性预测值为84%(42/50),阴性预测值为53.2%(66/124)。其中24例培养阳性患者中,CFP10-TRFIA共检测出24例。结论 CFP10-TRFIA可提高结核性胸腔积液的检出率,可作为结核性胸腔积液的快速诊断工具并为临床及时治疗提供参考。

结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶-6和滤液培养蛋白10及脂阿拉伯甘露聚糖联合检测对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶-6(ESAT-6)、滤液培养蛋白10(CFP-10)和脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)联合检测对结核性脑膜炎的诊断价值。方法选取2013年1月至2015年12月在台州市第一人民医院住院的结核性脑膜炎36例(结脑组)和病毒性脑膜炎30例(非结脑组)为研究对象,用常规和生化方法检测脑脊液的细胞计数、葡萄糖、蛋白质和氯化物,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测脑脊液中ESAT-6、CFP-10和LAM浓度,并用SPSS 14.0软件对两组数据进行t检验。结果结脑组脑脊液细胞计数和蛋白质浓度明显高于非结脑组,差异有统计学意义(t值分别为11.38、9.62,P<0.05),葡萄糖和氯化物浓度明显低于非结脑组,差异均有统计学意义(t值分别为-6.90、-11.92,P<0.05);结脑组ESAT-6、CFP-10和LAM浓度[分别为(36.50±9.14)pg/ml、(298.71±31.56)pg/ml、(8.62±2.35)mg/ml]明显高于非结脑组[分别为(7.84±0.86)pg/ml、(35.32±11.80)pg/ml、(5.13±1.74)mg/ml],差异均有统计学意义(P<0.05);ESAT-6、CFP-10、LAM检测阳性率偏低,联合检测能提高诊断效能,其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和约登指数分别为88.89%、93.33%、94.12%、87.50%和0.822 2。结论脑脊液中ESAT-6、CFP-10和LAM联合检测对结核性脑膜炎的早期诊断具有一定的实用价值。

结核性脑膜炎患者早期分泌性抗原-6和特异度抗原培养滤液蛋白-10水平变化及意义

目的监测结核性脑膜炎(TBM)患者结核分枝杆菌早期分泌性抗原-6(ESAT-6)和特异度抗原培养滤液蛋白-10(CFP-10)的动态变化并评估其临床意义。方法收集2013年1月-2016年12月在台州市第一人民医院治疗的结核性脑膜炎患者39例(TBM组)和非结核性脑膜炎53例(对照组)。同时,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测脑脊液中ESAT-6和CFP-10水平。结果 TBM组患者ESAT-6、CFP-10水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。ESAT-6诊断TBM的灵敏度、特异度和ROC曲线下面积(AUC)分别为79.5%、90.6%、0.922。CFP-10诊断TBM的灵敏度、特异度和AUC分别为87.2%、86.8%、0.894。随着疾病的进展,TBM患者ESAT-6、CFP-10水平逐渐下降,且治疗3个月后,TBM组患者ESAT-6、CFP-10水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 ESAT-6和CFP-10可以作为结核性脑膜炎的快速、准确的诊断指标。

时间分辨荧光分析法测定CFP10对结核性胸腔积液的临床诊断价值

目的 探讨时间分辨荧光免疫分析法测定抗原培养滤液蛋白10(CFP10)对于鉴别诊断结核性胸腔积液的临床价值。方法 于2016年1月至12月收集本院收治的106例结核性胸腔积液病例(TBPE组)与50例癌性胸腔积液病例(CPE组)的胸腔积液(CPE组)标本,同时纳入50例健康对照组。检测胸腔积液中CFP-10抗原,比较3组病例CFP10的差异;并与血T-SPOT.TB检测结果比较。结果 TBPE的CFP10水平(12.47±2.42)ng/ml显著高于CPE组(3.18±0.26)ng/ml,健康对照组(0.18±0.05)ng/ml,差异有统计学意义(t=32.69,P<0.01)。TBPE组ROC曲线的AUC=0.918。取临界值为11.92ng/ml时,灵敏度与特异度分别为96.23%与94.00%,TBPE组的阳性率(96.23%)高于CPE组(6.00%),差异有统计学意义(χ2=125.69,P<0.01)。血T-SPOT.TB法灵敏度与特异度分别为82.08%与90.00%。结论 CFP-10抗原检测可有效地鉴别诊断结核性胸腔积液与癌性胸腔积液,值得临床进一步推广应用。

结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

目的:克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10(CFP10)基因,并对其进行序列分析。方法:自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFP10基因设计引物。通过聚合酶链反应(PCR)技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果:PCR产物电泳显示扩增片段约为300 bp,测序获得的片段开放编码框由303 bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100%,推导出编码氨基酸序列同源性为100%。结论:成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFP10基因序列无差异。

和厚朴酚抑制CFP-10、ESAT-6诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞炎症因子表达

目的 研究和厚朴酚（HNK）对早期分泌抗原靶蛋白6（ESAT-6）和培养滤液蛋白10（CFP-10）作为特异性抗原刺激人肺泡Ⅱ型上皮细胞（A549）炎症因子表达的抑制作用,探讨抗炎在结核病治疗中的潜在价值.方法 用MTS法检测HNK（0～80μmol/L）对A549细胞的毒性反应,确定合适的药物实验浓度.用ELISA法检测以CFP-10、ESAT-6（0～40μg/ml）为抗原刺激的A549表达IL-8水平,选择最适刺激浓度.将A549细胞与CFP-10,ESAT-6及不同浓度的HNK（0～20μmol/L）共同培养24h后收集培养上清液和细胞,用ELISA法检测各组培养上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及Rantes的表达水平,分析HNK对细胞因子的剂量依赖抑制.结果 20μmol/L及以下的HNK浓度对A549细胞无明显毒性反应.抗原最适刺激浓度为5μmol/L.CFP-10,ESAT-6刺激可显著诱导A549细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及Rantes的产生.HNK（0～20μmol/L）剂量依赖性地抑制CFP-10,ESAT-6诱导的炎症因子的表达.结论 HNK能有效抑制CFP-10,ESAT-6诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞炎性细胞因子的表达.

CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒的构建和表达

目的:构建结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,M.tb)CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒,并且在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法:以M.tb H37Rv株DNA作为模板,PCR法扩增ESAT6和PPE68基因,利用基因拼接技术中的Gene-SOEing法扩增ESAT6-PPE68融合基因,克隆至原核表达质粒pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68。再分别以H37Rv株DNA和重组质粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68为模板扩增CFP10和ESAT6-PPE68基因,Gene-SOEing法获取目的基因CFP10-ESAT6-PPE68,克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-ESAT6-PPE68,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果:CFP10-ESAT6-PPE68酶切片段大小与理论值符合,基因测序结果显示融合基因CFP10-ESAT6-PPE68的序列与Genbank中序列一致,并在大肠杆菌中成功诱导表达了目的蛋白,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,相对分子量约为77 kD。结论:成功构建了M.tb CFP10-ESAT6-PPE68融合基因的原核表达质粒,并诱导表达出了融合蛋白,为该融合蛋白在结核病血清诊断学中的应用奠定了实验基础。

抗结核分枝杆菌培养滤液蛋白10的新型单克隆抗体的制备及其临床应用

目的 制备抗结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP-10)特定抗原肽的单克隆抗体,为建立结核病临床早期诊断的免疫学方法奠定物质基础.方法 设计并合成结核分枝杆菌CFP-10第53 ～ 66位氨基酸(14肽AAVVRFQEAANKQK)作为特定的抗原肽序列,经免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经酶联免疫吸附试验(ELISA)检测、多次有限稀释亚克隆建立能稳定分泌抗结核分枝杆菌特异抗原肽单克隆抗体的杂交瘤细胞系,纯化该单克隆抗体,进行免疫球蛋白亚型分析,并鉴定分析该单克隆抗体在蛋白质免疫印迹法(Western blotting)、免疫沉淀法和ELISA检测中的应用效果.共检测结核分枝杆菌培养上清样本38份,非结核分枝杆菌培养上清样本20份,结核性胸水样本32份,非结核性胸水样本24份以及健康对照血清样本20份.结果 单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示该杂交瘤细胞系产生的抗体类型为IgG1和κ型.该抗结核分枝杆菌CFP-10特异性单克隆抗体可成功用于Western blotting和免疫沉淀法分析.ELISA定量检测显示,该特异性抗体检测结核分枝杆菌的敏感性为78.6％ (55/70),特异性为92.2％ (59/64).结论 CFP-10特定抗原肽单克隆抗体用于结核分枝杆菌检测有较高的敏感性和特异性,可用于结核病的早期诊断.

纳米磁珠偶联CFP-10特异性单抗富集结核分枝杆菌方法的建立

目的:初步建立基于纳米磁珠偶联培养滤液蛋白10(CFP-10)特异性单抗富集结核分枝杆菌的方法。方法:大肠杆菌表达CFP-10抗原,采用鼠杂交瘤技术制备相应的CFP-10单抗,用NHS修饰的纳米磁珠偶联单抗,用以捕获结核分枝杆菌并进行抗酸染色检测。结果:制备的CFP-10单抗效价为1∶640000;免疫荧光检测显示CFP-10抗体偶联到磁珠上,抗酸染色验证了磁珠偶联的单抗能有效地捕获富集结核分枝杆菌。结论:建立了纳米磁珠偶联CFP-10特异性单抗有效捕获富集结核分枝杆菌的方法,为提高抗酸染色方法的阳性检出率奠定了基础。

评价γ干扰素释放分析T-SPOT.TB在肺外结核病诊断中的敏感性

目的评价γ干扰素释放分析T-SPOT.TB检测在肺外结核病诊断中的敏感性。方法对北京协和医院根据细菌学或/和组织学诊断的肺外结核患者31例,应用酶联免疫斑点技术检测6kD早期分泌靶向抗原和10kD培养滤过蛋白肽段库刺激后外周血中释放γ-干扰素的特异性T细胞。结果31例肺外结核患者中29例T-SPOT.TB检测阳性,敏感性为93.5%(95%CI84.8%～100%),6kD早期分泌靶向抗原肽段库刺激后斑点形成细胞数中位数为196/106PB-MCs(4分位间距72～532/106PBMCs),10kD培养滤过蛋白肽段库刺激后斑点形成细胞数中位数为276/106PBMCs(4分位间距72～568/106PBMCs),对两个肽段库总的斑点形成细胞中位数为612/106PBMCs(4分位间距192～1152/106PBMCs)。结论T-SPOT.TB检测对肺外结核诊断具有较高的敏感性。

外周血T-SPOT.TB预测结核性胸膜炎患者病情稳定快慢的价值

目的通过分析结核性胸膜炎患者外周血结核感染T细胞斑点实验(T-SPOT.TB)与胸腔积液消失时间的相关性,探讨T-SPOT.TB在预测结核性胸膜炎患者病情稳定快慢中的价值。方法选择住院治疗并确诊为结核性胸膜炎的患者99例,采用酶联免疫斑点技术检测外周血中经6 kD早期分泌靶抗原和10 kD培养滤过蛋白刺激后释放相应γ干扰素的特异性T细胞,分别记为T-SPOT.TB评分的A值、B值。所有患者均在正规抗结核基础上行胸腔穿刺术及胸腔闭式引流术,记录胸腔积液消失所需要的时间。分析T-SPOT.TB评分与胸腔积液消失时间的相关关系。结果 99例患者中T-SPOT.TB阳性者89例,外周血T-SPOT.TB诊断结核性胸膜炎的敏感性为89.9%。T-SPOT.TB评分中A值均值为(61.3±5.2)/106PBMCs,B值均值为(74.8±3.5)/106PBMCs,A+B值均值为(136.1±3.2)/106PBMCs,胸腔积液消失时间均值为(11.7±4.2)d。A值、B值、A+B值与胸腔积液消失时间均呈正相关(r A=0.72,P A<0.001;r B=0.71,P B<0.001;r A+B=0.89,P A+B<0.001)。结论外周血T-SPOT.TB在结核性胸膜炎的诊断中具有重要价值,其评分越高,结核性胸膜炎患者胸腔积液消失时间越长,T-SPOT.TB可以作为预测及评估结核性胸膜炎患者病情稳定快慢的一个重要指标。

结核感染T细胞斑点试验对结核病治疗效果的监测价值

目的探讨结核感染T细胞斑点试验对结核病治疗疗效的监测意义。方法本研究采用T-SPOT.TB试剂盒,检测T细胞中γ-干扰素对结核分支杆菌特异性多肽类早期分泌性抗原靶标6-k D(ESAT-6)和培养滤液蛋白(CFP-10)的应答,对比113例结核感染者治疗前与治疗后T-SPOT.TB结果的变化,其结果根据对该试验中两种抗原的联合与各自应答来分析。结果 113例感染者在治疗后T-SPOT.TB结果转阴者有42例(37.2%)。其中,CFP-10转阴率占48.9%(P<0.001),ESAT-6转阴率占20.0%(P=0.238)。ESAT-6的斑点形成细胞(SFCs)/2.5×105外周血单核细胞(PBMCs)的平均数在治疗前和治疗后分别为18.47和16.29(P=0.16),而CFP-10的SFCs/PBMCs的平均数在治疗前和治疗后分别为22.83和15.31(P<0.01)。结论结核病治疗对于T细胞中γ-干扰素引起的ESAT-6和CFP-10抗原应答影响不同,CFP-10的定量应答才是结核病治疗的更有效监测手段。

重组CFP10-PPE68融合蛋白检测结核分枝杆菌感染的初步应用

目的以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)RD1区特异性培养滤液蛋白10(culture filtrate pro-tein10,CFP10)与戊糖-5-磷酸-3-差异构象酶68(pentose-5-phosphate-3-epimerase68,PPE68)的融合蛋白CFP10-PPE68作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB抗体的间接ELISA法。方法采用亲和层析法纯化重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白;分别以3种蛋白作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB特异性抗体的间接ELISA法;采用方阵滴定法对建立的间接ELISA法的条件进行优化;并以临床诊断为金标准,对间接ELISA法的特异性、敏感性和准确性进行验证。结果纯化的重组CFP10-PPE68融合蛋白纯度约为70%。分别以重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白作为包被抗原的最佳包被浓度分别为2、4、4μg/ml,血清最佳稀释度均为1∶1 000,酶标二抗最佳稀释度均为1∶5 000。3种蛋白对肺外结核的诊断效果均优于肺结核,且重组CFP10-PPE68融合蛋白检测肺外结核的特异性、敏感性及准确性均最佳;3种蛋白诊断结核病的特异性较高,而敏感性相对较低。结论以重组CFP10-PPE68融合蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA法诊断MTB感染具有较高的敏感性和特异性,特别是对难以诊断的肺外结核病的诊断有一定的参考价值。

结核疫苗优势抗原ESAT6、CFP10的分子生物学基础及应用研究进展

早期分泌抗原靶分子6(ESAT6,后简称E6)和培养滤液蛋白10(CFP10,后简称C10)因能诱导宿主产生强烈细胞免疫应答,成为新型结核(TB)疫苗的热门优势抗原,在TB的预防、诊断等领域具有广阔的应用前景。本文汇集国际最新进展,从E6、C10的结构-功能、生物学特性、表达-分泌、宿主免疫及疫苗研究等全新视角对其进行分析与展望。